الإكثار المعملي واستخلاص بعض المركبات الفعالة الهامة في بعض النباتات الطبية

                                                الاكثارالمعملي واستخلاص بعض المركبات الفعالة الهامة لبعض النباتات الطبية

أجريت هذة الدراسة فى خلال الفترة من سنة 2002 الى سنة 2004 فى معمل زراعة الأنسجة بمركز الدراسات التطبيقية لبحوث النباتات الطبية التابع للهيئة القومية للرقابة والبحوث الدوائية. كان الهدف من هذه الدراسة هو الوصول الى أفضل المعاملات لاكثا ر ثلاثة نباتات من النباتات الطبية الهامة وهى التراجون ، بلح السكر ، الجنكوعن طريق ءاكثارها بواسطة تقنية زراعة الأنسجة باستخدام القمة النامية المحتوية على برعم واحد كمنفصل نباتى تم ءاستخدامه فى الزراعة وهذه المنفصلات النباتية تم أخذها من نباتا ت صغيرة نامية فى الصوبة عمرها يتراوح مابين 2-3 شهور و ذلك بالنسبة لكل من نبات التراجون وبلح السكر اما بالنسبة لنبات الجنكو تم أخذ المنفصل النباتى من افرع حديثة النمو من الشجرة الكبيرة الوحيدة فى  حديقة الأورمان علىمستوى جمهورية مصر العربية وهى شجرة وحيدة الجنس (مذ كر)  . وكان الهدف ايضا من الدراسة هو استخلاص بعص المواد الفعالة الهامة و الموجودة داخل النباتات النامية داخل المعمل كمنتجات ثانوية من هذه النباتات والتى قد يمكن استخدامها فى انتاج بعض الادوية و التى يدخل فى تركيبها بعض المستخلصات الطبيعية من نباتات طبية.

الأنواع النباتية المختارة فى هذة الدراسة : التراجون    Artemisia dracunculus L  ، بلح السكرBalanites aegyptiaca   ، الجنكو Ginkgo biloba .

ولقد قسمت الدراسة الى خمس مراحل وهى كالاتى :

مرحلة البداية ، مرحلة التضاعف ، مرحلة التجذير ، مرحلة الأقلمة، مرحلة تكوين الكالس.

 - أولا تجارب مرحلة البداية :

- بالنسبة لنبات التراجون Artemisia dracunculus L ،  بلح السكرBalanites aegyptiaca   و الجنكو Ginkgo biloba تم تعقيم المنفصل النباتى بطريقة الغمس فى الكحول 70% لمدة عدة ثوانى ثم الغمس فى محلول كلوريد الزئبقيق السليمانى بتركيز2, مليجرام/ لتر لمدة 2 د قيقة ثم الشطف ثلاث مرات بماء مقطر معقم . وتمت زراعة المنفصل النباتى فى وضع رأسى داخل البرطمنات المعقمه المحتوية على تركيزا ت مختلفة من أملاح  بيئة موراشيج وسكوج وبيئة جامبورج وبيئة النباتات الخشبية وبيئة وايت  الخا لية من أى منظمات نمو( قوه كاملة ،3/4 ،1/2 ،1/4 ،1/8  ) وتم تحضين هذه الأ جزاء داخل غرف التحضين تحت 25 درجه مئوية لمدة 6 أسابيع وباستخدام لمبات فلورسنت بيضاء ذات شدة اضاءة 2000 لكس و لفترات اضاءة 16 ساعة يوميا وفترات اظلام 8 ساعات على التوالى .

وقد أتضح أن أفضل بيئة لنمو المنفصل النباتى المستخدم هى بيئة 3/4 موراشيج وسكوج الخالية من أى منظمات نمو وهى أفضل بيئة للحصول على أكبر عدد من الأفرع الجانبية وأكبرعدد من الأوراق والأفضل لاستطالة النبتا ت وتكوين الجذور .

أوضحت النتائج ان بيئة النباتات الخشبية وكذلك بيئة وايت لم تعطى أى استجابة لنمو المنفصل النباتى عليها لذلك تم اسبعادها من المراحل التالية فى التجارب .  

  - ثانيا تجارب مرحلة التضاعف :

- بالنسبة لنبات الاستراجون Artemisia dracunculus L :

  و فى مرحلة التضاعف تم أخذ النموات الخضرية الناتجة من مرحلة البداية و زراعتها مرة أخرى على أفضل بيئة ثبت نجاحها من مرحلة البداية  وهى 3/4 بيئة موراشيجى و سكوج ولقد تم التحضين تحت نفس الظروف السابق ذكرها فى مرحلة البداية . ولقد تمت دراسة تأثير كل من منظمات النمو  البنزايل أدينين ، الثديازورون ، ا ندول  حمض البيوتريك ، البيكلورام  بالتركيزا ت التالية 0, / 05,/ 1,/ 2,/ 4 / ,8 /,6,1 /2,3 مليجرام فى اللتر على نمو و تطور النبتا ت الناتجة من مرحلة البداية .

 و لقد أثبتت النتائج أن أفضل بيئة للتضاعف للحصول على عدد كبير من النبتات  كانت بيئة 3/4 موراشيج و سكوج مضافاءاليها2 ,مليجرام فى اللتربنزايل أدينين أو8, مليجرام فى اللتر اندول حمض البيوتريك. بينما أفضل بيئة للحصول على أطول النبتا ت كانت 3/4 موراشيج وسكوج مضافا أليها 8,مليجرام فىاللتراندول حمض البيوتريك .ولقد تم ايضا دراسة أفضل تركيز من اندول حامض البيوتريك 8,  مليجرام فى اللتر مع أفضل تركيز من البنزايل أدنين 2, مليجرام فى اللتر ولقد أثبتت النتائج أنه ليس هناك فرق معنوى بين استخدام كل من الهرمونين مع بعضهما  أو باستخدام أى منهما بالتركيزات السابق ذكرها على جميع الصفات التى تم قياسها والسابق ذكرها .

أما بالنسبة للتركيزات المستخدمة من كل من الثد يازورون والبيكلورام لم تحد ث أى نتيجة ءايجابية لنمو الأجزاء المنزرعة بل أدت الى تكوين الكالوس بدرجات متفاوتة وكانت أفضل بيئة لاعطاء أكبر كمية كالس هى بيئة 3/4 موراشيجى وسكوج المضاف اليها 2,3 ثديازورون أو5., بيكلورام مليجرام فى اللتر .

- بالنسبة لنبات بلح السكر Balanites aegyptiaca  :

و فى مرحلة التضاعف تم أخذ النموات الخضرية الناتجة من مرحلة البداية و زراعتها مرة أخرى على أفضل بيئة ثبت نجاحها من مرحلة البداية وهى 3/4 بيئة موراشيجى و سكوج  ولقد تم التحضين تحت نفس الظروف السابق ذكرها فى مرحلة البداية . ولقد تمت دراسة تأثير كل من منظمات النمو  البنزايل أدينين ، الثديازورون ، ا ندول  حمض البيوتريك ، البيكلورام  بالتركيزا ت التالية 0, / 05,/ 1,/ 2,/ 4 / ,8 /,6,1 /2,3 مليجرام فى اللتر على نمو و تطور النبتا ت الناتجة من مرحلة البداية.

 و لقد أثبتت النتائج أن أفضل بيئة للتضاعف للحصول على عدد كبير من النبتات  كانت بيئة 3/4 موراشيج و سكوج مضافاءاليها05 ,مليجرام فى اللتربنزايل أدينين  أو بيئة 3/4 موراشيجى و سكوج الخالية من منظمات النمو . بينما أفضل بيئة للحصول على أطول النبتا ت كانت 3/4 موراشيج وسكوج الخالية من منظمات النمو.ولقد تم ايضا دراسة أفضل تركيز من اندول حامض البيوتريك 2,3  مليجرام فى التر مع أفضل تركيز من البنزايل أدنين 05, مليجرام فى اللتر ولقد أثبتت النتائج أن هناك فرق معنوى بين استخدام كل من الهرمونين مع بعضهما  أو باستخدام أى منهما بالتركيزات السابق ذكرها على جميع الصفات التى تم قياسها والسابق ذكرها وأن أفضل بيئة لأفضل نمو واعطاء أكبر عدد من الأفرع والأوراق وأطول النبتا ت وتكوين الجذور هى بيئة 3/4 موراشيج وسكوج المضاف اليها 05 ,مليجرام فى اللتربنزايل أدينين وكذلك 1.6 مليجرام فى اللتر من الثد يازورون .

أما بالنسبة للتركيزات المستخدمة من البيكلورام لم تحد ث أى نتيجة ءايجابية لنمو الأجزاء المنزرعة ولقد أدت الى تكوين الكالوس بدرجات متفاوتة وكانت أفضل بيئة لاعطاء أكبر كمية كالس هى بيئى 3/4 موراشيجى وسكوج المضاف اليها  4, بيكلورام مليجرام فى اللتر .

-  بالنسبة لنبات الجنكو Ginkgo biloba :

و فى مرحلة التضاعف تم أخذ النموات الخضرية الناتجة من مرحلة البداية و زراعتها مرة أخرى على أفضل بيئة ثبت نجاحها من مرحلة البداية وهى 3/4 بيئة موراشيجى و سكوج  ولقد تم التحضين تحت نفس الظروف السابق ذكرها فى مرحلة البداية . ولقد تمت دراسة تأثير كل من منظمات النمو  البنزايل أدينين، الثديازورون ، ا ندول  حمض البيوتريك ، البيكلورام  بالتركيزا ت التالية : 05,/ 1,/ 2,/ 4 / ,8 /,6,1 /2,3 مليجرام فى اللتر على نمو و تطور النبتا ت الناتجة من مرحلة البداية و لقد لوحظ ان هذة التركيزات لم تعطى أى ءاستجابة ملحوظة للنمو بالنسبة للاجزاء النباتية المنزرعة . لذلك تم تجربة تركيزات أخرى من البنزايل أدنين وهى 5,  /   1.5 /0,2/ 5,2 ولقد أثبتت النتائج أن بيئة 3/4 موراشيج وسكوج المضاف اليها 2 مليجرام فى اللتر بنزايل أدنين هى أفضل بيئة للنمو .

- ثالثا تجارب مرحلة التجذير :

 - بالنسبة لنبات الاستراجون L Artemisia dracunculus :

اما فى مرحلة التجذيرقد تم  زراعة النموات الخضرية الناتجة من مرحلة التضاعف وزراعتها مرة أخرى باء ستخدام بيئة 3/4 موراشيجى وسكوج المضاف اليها تركيزات مختلفة من الفلوروجليسينول (162/121/81/ 40 مليجرام فى اللتر).

 وكذلك تم ءاستخدام تركيز 8 ,مليجرام فى اللتر اندول حامض البيوتريك  بالاضافة الى التكيزات السابقة من الفلورو جليسينول وتم التحضين تحت نفس الظروف السابق ذكرها فى المرحلتين السابقين . و كانت أفضل بيئة للتجذيرهى 3/4 موراشيج وسكوج المضافءاليها 162 مليجرام فى اللتر من الفلوروجليسينول أو المضاف ءاليها08 , اندول حامض البيوتريك مع 81 من الفلوروجليسينول مليجرام في اللتر .

- بالنسبة لنبات بلح السكر Balanites aegyptiaca  :

اما فى مرحلة التجذيرقد تم  زراعة النموات الخضرية الناتجة من مرحلة التضاعف وزراعتها  مرة أخرى باء ستخدام بيئة 3/4 موراشيجى وسكوج المضاف اليها تركيزات مختلفة من الفلوروجليسينول (162/121/81/ 40 مليجرام فى اللتر) .

 وكذلك تم ءاستخدام تركيز 2, 3 مليجرام فى اللتر اندول حامض البيوتريك  بالاضافة الى التكيزات السابقة من الفلورو جليسينول . وتم التحضين تحت نفس الظروف السابق ذكرها فى المرحلتين السابقين .

 ولقد أثبتت النتائج أنه لم تحدث أى ءاستجابة لتكوين الجذور على التركيزات السابقة وأن أفضل بيئة لتكوين الجذور هى بيئة 3/4 موراشيج وسكوج الخالية من أى منظمات نمو .

-  بالنسبة لنبات الجنكو Ginkgo biloba :

 فى مرحلة التجذيرقد تم  زراعة النموات الخضرية الناتجة من مرحلة التضاعف وزراعتها 

 مرة أخرى باء ستخدام بيئة 3/4 موراشيجى وسكوج المضاف اليها تركيزات مختلفة من الفلوروجليسينول (162/121/81/ 40 مليجرام فى اللتر) وكذلك تم ءاستخدام تركيزات 5 ،10 ،15 ، 20 ، مليجرام فى اللتر من اندول حامض البيوتريك  . وتم التحضين تحت نفس الظروف السابق ذكرها فى المرحلتين السابقين . ماعدا تجربة تركيزات اندول حامض البيوتريك فقد تم تحضين المنفصلات المنزرعة تحت ظروف اءلا ظلام الكامل لمدة أسبوع ثم تم ءاعادة تحضينها تحت ظروف اءلاضاءة مرة أخرى لمدة خمسة أسابيع .

وقد أوضحت النتائج  أنه لم تحدث أى ءاستجابة لتكوين الجذور على جميع التركيزات السابقة .

- رابعا تجارب مرحلة الأقلمة :

فى هذة المرحلة تم نقل النباتات الناتجة من مرحلة التجذير ءا لى أصص بلاستيك مقاس  12سم مملؤة بخلطات مختلفة كالتالى .

 -  بالنسبة لنبات الاستراجون L Artemisia dracunculus :

 و قد تم أقلمة النباتات الناتجة من زراعة الأنسجة على بيئات زراعة مختلفة وهى بيت موس ، رمل ، فيرموكليت ، بيت موس : رمل 1:1 حجما ، بيت موس :  فيرموكليت 1:1 حجما ، رمل : فيرموكليت 1:1 حجما ، بيت موس : رمل : فيرموكليت 1:1:1 حجما .

 وكانت أفضل بيئة للأقلمة هى البيت موس : الرمل بنسبة 1:1حجما وكانت نسبة النجاح 75% .

- بالنسبة لنبات بلح السكر Balanites aegyptiaca  :

و قد تم أقلمة النباتات الناتجة من زراعة الأنسجة على بيئات زراعة مختلفة وهى بيت موس ، رمل ، فيرموكليت ، بيت موس : رمل 1:1 حجما ، بيت موس :  فيرموكليت 1:1 حجما ، رمل : فيرموكليت 1:1 حجما ، بيت موس : رمل : فيرموكليت 1:1:1 حجما .

 وكانت أفضل بيئة للأقلمة هى البيت موس : الرمل بنسبة 1:1حجما وكانت نسبة النجاح 75% بالنسبة لنبات التراجون وكانت نسبة النجاح بالنسبة لنبات بلح السكر تتراوح مابين 93.75-100% .

-  بالنسبة لنبات الجنكو Ginkgo biloba :

لم تتم أى تجارب للأقلمة  لهذا النبات  نظرا  لعدم  تكون  أى  جذور على النبتات  الناتجة  من مرحلة التضاعف .

 - خامسا تجارب مرحلة تكوين الكالس :

أما فى مرحلة تكوين الكالس فقد تمت زراعة النموات الخضرية الناتجة من مرحلة التضاعف بعد تجزأتها ءالى قطع صغيرة وذلك  لكل نبتتين كاملين فقط فى كل مكررة فى كل برطمان .

بالنسبة لنبات الاستراجون L Artemisia dracunculus :

تم زراعة المنفصلات النباتية المجزأة على بيئة 3/4 موراشيج وسكوج المضاف اليهاالتركيزات التالية :  05,/ 1,/ 2,/ 4 / ,8 /,6,1  مليجرام فى اللتر  بيكلورام.

  و5,  ،1، 1.5، 3 ، 4.5 ، 6 ، 7.5 مليجرام فى اللتر2,4-D . ولقد تم التحضين تحت نفس الظروف السابق ذكرها فى المراحل السابقة .

وقد أوضحت النتائج  أن أفضل معاملة لتكوين الكالس هى 1.5 مليجرام /اللتر2,4-D و05, بيكلورام  ولقد أدى تركيز 6 مليجرام فى اللتر من 2,4-D الى اعادة تكشف بعض النبتات المجزأة مرة أخرى الى تكوين نبتات كاملة.

- بالنسبة لنبات بلح السكر Balanites aegyptiaca  :

تم زراعة المنفصلات النباتية المجزأة على بيئة 3/4 موراشيج وسكوج المضاف اليهاالتركيزات التالية :  05,/ 1,/ 2,/ 4 / ,8 /,6,1 /2,3 مليجرام فى اللتر  بيكلورام و5,  ،1، 1.5، 3 ، 4.5 ، 6 ، 7.5 مليجرام فى اللتر2,4-D . ولقد تم التحضين تحت نفس الظروف السابق ذكرها فى المراحل السابقة .

وقد أوضحت النتائج  أن أفضل معاملة لتكوين الكالس هى 7.5 مليجرام /اللتر2,4-D و4, أو                                        2, بيكلورام  مليجرام فى اللتر.

-  بالنسبة لنبات الجنكو Ginkgo biloba :

تم زراعة المنفصلات النباتية المجزأة على بيئة 3/4 موراشيج وسكوج المضاف اليهاالتركيزات التالية :  05,/ 1,/ 2,/ 4 / ,8 /,6,1 /2,3 مليجرام فى اللتر  بيكلورام و5,  ،1، 1.5، 3 ، 4.5 ، 6 ، 7.5 مليجرام فى اللتر2,4-D  ولقد تم التحضين تحت نفس الظروف السابق ذكرها فى المراحل السابقة .

أوضحت النتائج أن هذة التركيزات لم تعطى أى نتيجة لتكوين الكالس .

-              سادسا: تقدير و استخلاص بعض المواد الفعالة.   

-              بالنسبة لنبات التراجون :

 تم استخلاص وتقدير نسبة الزيت الطيار داخل محتوى النباتات الناتجة من زراعة الأنسجة باستخدام جهاز التقطير المائى ولقد اثبتت النتائج المتحصل عليها أن نسبة الزيت الطيار فى العينة الطازجة للنباتات النامية فى المعمل كانت 05 % ,وفى العينة الطازجة للنباتات النامية فى الحقل الخارجى كان 43 , %.

-              بالنسبة لنبات بلح السكر :

تم استخلاص وتقدير نسبة المواد الصابونينية داخل محتوى النباتات الناتجة من زراعة الأنسجة باستخدام جهاز السبكتروفوتوميتر ولقد اثبتت النتائج المتحصل عليها أن نسبة المواد الصابونينية كانت 10,34%    وفى الثمار كانت 62.30%.

-              بالنسبة لنبات الجنكو :

تم استخلاص وتقدير نسبة المواد الفلافودنية داخل محتوىالاوراق الجافة لنيات الجنكو للنباتات النامية داخل المعمل ولقد اثبتت النتائج المتحصل عليها أن نسبة المواد الفلافودنية ممثلة فى مركب الجنكولويد كانت 0.025% من النبات و كانت النسبة داخل محتوىالاوراق الجافة لنيات الجنكو للنباتات النامية خارج المعمل4 0, %."