استخدام التقنيات الحديثة في تقسيم بعض أكاروسات الحيوان في مصر

 

 

                                                "       يعتبر القراد و الحلم المتطفل من أهم الآفات الأقتصادية اجبارية التطفل خارجيا و داخليا على الحيوانات و طيور المزرعة التي تسبب لها خسائر اقتصادية عديدة من أهمها نزف دم العائل و تأثير ذلك على البروتين الناتج كما انه يسيطر على ردود فعل العائل المناعية و الألتهابية نتيجة فترة التغذية الطويلة  .

و هما من أكثر ناقلات الأمراض للحيوانات أهمية. كما أنهما ينقلا أعداد متنوعة من الأمراض أكثر من أى من مفصليات الأرجل الأخرى التى تتغذى على الدم و تشمل قائمة مسببات الأمراض التى ينقلها الطفيل خاصة القراد ( فطريات – فيروسات – الركتسيا – الأسبيروكيت – بكتريا – بروتوزوا).

و من اكثر الأمراض التى ينقلها على مدى واسع لللأنسان هو مرض اللايم الذى ينتشر فى الولايات المتحدة الأمريكية. و من أكثر أنواع الأمراض التي ينقلها الحلم للإنسان و الحيوان هي الأمراض الجلدية و خصوصا أمراض الجرب.

       لعمل تصنيف لأنواع القراد و الحلم المتطفل كان يعتمد على تفاصيل الشكل المورفولوجي و هذه الطريقة قد لا تصلح للتصنيف عند حدوث أى تكسير فى أعضاء الشكل الخارجى و لذلك تم عمل دراسة جينية كبداية لعمل خريطة جينية للتفريق بين هذه الأنواع. 

الأهداف:

1-            عمل خريطة وراثية للأنواع الآتية:

 من القراد

( A. persicus – A. arboreus – R. sangineus) قراد الغنم و الكلاب – قراد أبو قردان – قراد الدواجن 

و من الحلم

 (Psoroptes cuniculi - P. natalensis – Dermanyssus gallinae)

حلم الدواجن – حلم جرب المواشي – حلم جرب الأرانب

و ذلك بالأعتماد على  RAPD–PCR

2- ايجاد علاقة القرابة بين ثلاثة أنواع من القراد و علاقة القرابة بين نوعين من أنواع الحلم و دراسة نوع ثالث من الحلم.

3- الدراسة الهستولوجية نتيجة اصابة الأرانب بالنوع P. cuniculi

4 - تحديد الأختلافات المورفولوجية بين ثلاثة أنواع من جنس  Psoroptes

(Psoroptes cuniculi - Ps. natalensis – Ps ovis) 

طرق البحث :

أولا : القراد

          أولا : الدراسات الحقلية :

- جمع و حفظ العينات.

1- قراد الكلاب: Rhipicephalus sanguineus

      تم جمع عينات قراد الكلاب خلال الفترة من مايو الى أغسطس 2002 من مناطق مختلفة فى محافظة القاهرة و الجيزة .

و تم الجمع من مناطق مختلفة من جسم الحيوان مثل الرقبة و داخل الأذن و تحت الأبط و حول الذيل.

تم جمع العينات بواسطة الملاقط ووضعها داخل أنابيب من البلاستيك و تم تغطية الأنابيب بواسطة القماش الدمور مع احكام الغلق بواسطة( الأستيك) مع كتابة البيانات الخاصة بالتاريخ و مكان الجمع و العائل.

و فى المعمل تم تنظيف العينات من المخلفات و تعريفها و فصلها الى أطوارها المختلفة ( ذكور – اناث – حوريات ).

ثم يتم حفظ القراد حيا تهيئة لتربيته  في حضانات على درجة حرارة 27– 28 ° م و رطوبة 75 %. 

2 - قراد الدجاج Argas persicus

     تم جمع عينات قراد الدواجن خلال الفترة من ابريل الى أغسطس 2002 من مزارع الدواجن التابعة لكلية الزراعة – جامعة القاهرة بالجيزة.

     تم جمع عينات القراد من شقوق الجدران بواسطة الملاقط ووضعه داخل أنابيب من البلاستيك و تم تغطية الأنابيب بواسطة قماش الدمور مع أحكام الغلق بواسطة( الأستيك) مع كتابة البيانات الخاصة بالتاريخ و مكان الجمع و العائل.

و فى المعمل تم تنظيف العينات من المخلفات و تعريفها و فصلها الى أطوارها المختلفة ( ذكور – اناث – حوريات ).

ثم يتم حفظ القراد حيا تهيئة لتربيته فى حضانات على درجة حرارة 27– 28 ° م و رطوبة 75 % . 

3- قراد ابو قردان  Argas arboreus

     تم جمع عينات قراد  أبو قردان خلال الفترة من أغسطس الى ديسمبر 2002 و ذلك من الأشجار الكافور المحيطة لحديقة الحيوان بالجيزة .

تم جمع عينات القراد من شقوق و تحت قلف لأشجار الكافور بواسطة الملاقط ووضعه داخل أنابيب من البلاستيك و تم تغطية الأنابيب بواسطة قماش الدمور مع أحكام الغلق بواسطة( الأستيك) مع كتابة البيانات الخاصة بالتاريخ و مكان الجمع و العائل.

و فى المعمل تم تنظيف العينات من المخلفات و تعريفها و فصلها الى أطوارها المختلفة ( ذكور – اناث – حوريات ).

ثم يتم حفظ القراد حيا تهيئة لتربيته  في حضانات على درجة حرارة 27– 28 ° م و رطوبة 75 %. 

ثانيا : انشاء مستعمرات  القراد المعملية :

- قراد الدواجن و قراد أبو قردان .

تم تربية كل من قراد الدواجن و قراد أبو قردان داخل  المعمل درجة حرارة 27 – 28 ° م و رطوبة 75 %  و تم استخدام الحمام لتغذية كل أطوار كلا من النوعين .  

 طرق التغذية للأطوار المختلفة من القراد اللين :

ا. الأطوار البالغة و الحوريات :

- ينزع الريش من الحمام من تحت الجناحين قبل التغذية ثم يتم ربط الأجنحة معا و كذلك الأرجل و بعد ذلك توضع قطعة من البلاستير على المنقار لمنع الطائر من التقاط العينات .

- توضع كل حمامة فى طبق من البلاستيك و يوضع عليها القراد المراد تغذيتة و يغطى الجميع بقطعة من القماش الأسود للأظلام ثم تترك لمدة 2 – 3 ساعات .

- بعد ذلك تجمع الأفراد المتغذية و تستقبل على أطباق بترى مبطن بورق ترشيح حتى تجف من السائل الذى يفرزه القراد بعد التغذية مباشرة ... ثم توضع هذه الأفراد فى أنابيب بلاستيك تحتوى على قطع صغيرة من ورق الترشيح لاستكمال تجفيفها ثم تغطى بالقماش. 

ب. الطور اليرقى :

- يتم نزع الريش من على جناح واحد من الحمامة بأكمله قبل التغذية ب 24 ساعة.

- بعد ذلك تثبيت قطعة رفيعة من الأسفنج حول الجناح ثم يثبت عليها كيس من القماش مفتوح من الطرفين.

- توضع اليرقات من الطرف الغير مثبت داخل الكيس ثم يغلق بالبلاستر و تجمع الأفراد المتغذية يوميا من خلال الطرف الحر للكيس. 

2- قراد الكلاب

- تم تربية قراد الكلاب داخل  المعمل درجة حرارة 27 – 28 ° م و رطوبة 75 %  و تم استخدام الأرانب لتغذية كل أطواره.

- يحلق شعر الأرنب من على جانبى الظهر و يترك لمدة 24 ساعة ثم يتم عمل كبسولات تلصق على الظهر المحلوق و يترك 24 ساعة حتى تتطاير رائحة الغذاء... توضع ورقة كارتون مقوى حول رقبة الأرنب لمنعه من نزع الكبسولات ... تغطى الكبسولات بعد وضع أطوار القراد المختلفة المتغذية بقطعة قماش دمور و تثبت بأستيك مطاطى ثم بلاستر و يراقب القراد يوميا بعد ذلك لتدوين مراحل أطوار الحياة المختلفة. 

ثانيا: الحلم المتطفل

جمع و حفظ العينات :

- 1 حلم جرب المواشي Psoroptes natalensis

     تم جمع عينات الحلم من على الجاموس و ذلك فى خلال الفترة من شهر يونيو 2003 الى أغسطس 2004.

و ذلك من المزرعة الشرقية لكلية الزراعة جامعة القاهرة.

و من منطقة كفر طهرمس فى محافظة الجيزة.

- و تم الجمع من أماكن مختلفة من جسم الحيوان ( الأنف – الأذن – الأرجل و من أعلى الظهر و حول منطقة الزبل.

- تم جمع العينات عن طريق دهن الأماكن المصابة بالجلسرين ثم بواسطة المشرط حاد يتم كشط هذه الأماكن المصابة حتى يسيل الدم فى أطباق بترى و تنقل العينلت الى المعمل بعدما يكتب عليها مكان الجمع و العائل و مكان الأصابة و تاريخ جمع العينة.

تؤخذ العينات و توضع فى جهاز الطرد المركزى على 15000 لفة لمدة 3 دقائق ثم يتم جمع الأفراد دون المخلفات بواسطة الفرشاة.

و يتم تقسيم العينات التى تم جمعها الى مجموعتين ... واحدة تستخدم فى فصل المادة الوراثية DNA

و المجموعة الأخرى توضع فى محلول نسبت لمدة من 6 – 12 ساعة و منه الى محلول Hoyer’s

. على الشريحة التى توضع على ال Hot plateو ذلك لفحص العينات و التعرف عليها و رسمها. 

 -2حلم جرب الأرانب Psoroptes cuniculi

         تم جمع العينات من على  الأرانب فى خلال الفترة من شهر مايو الى نوفمبر 2003 و ذلك من المزرعة الشرقية و الغربية لكلية الزراعة جامعة القاهرة و مزرعة فى طريق مصر الأسماعيلية.

و تم جمع العينات من أذن الأرانب فقط. و ذلك عن طريق عمل سلخ بين أذن الأرنب و الكتلة الشمعية المحتوية على أفراد الجرب.

تأخذ العينات و توضع فى جهاز الطرد المركزى على 15000 لفة لمدة 3 دقائق ثم يتم جمع الأفراد دون المخلفات بواسطة الفرشاة.

و يتم تقسيم العينات التى تم جمعها الى مجموعتين ... واحدة تستخدم فى فصل المادة الوراثية DNA

و المجموعة الأخرى توضع فى محلول نسبت لمدة من 6 – 12 ساعة و منه الى محلول Hoyer’s

. على الشريحة التى توضع على ال Hot plateو ذلك لفحص العينات و التعرف عليها و رسمها. 

– 3 حلم جرب الغنم  Psoroptes ovis

         تم جمع العينات  من على الخراف و الماعز من المزرعة الشرقية لكلية الزراعة جامعة القاهرة و العديد من الأسواق بمنطقة كفر طهرمس و ذلك فى خلال الفترة من مارس الى أغسطس 2004        

- و تم الجمع من أماكن مختلفة من جسم الحيوان ( الأنف – الأذن – الأرجل و من أعلى الظهر و حول منطقة الذيل.

- تم جمع العينات عن طريق دهن الأماكن المصابة بالجلسرين ثم بواسطة المشرط حاد يتم كشط هذه الأماكن المصابة حتى يسيل الدم فى أطباق بترى و تنقل العينلت الى المعمل بعدما يكتب عليها مكان الجمع و العائل و مكان الأصابة و تاريخ جمع العينة.

تأخذ العينات و توضع فى جهاز الطرد المركزى على 15000 لفة لمدة 3 دقائق ثم يتم جمع الأفراد دون المخلفات بواسطة الفرشاة.

و يتم تقسيم العينات التى تم جمعها الى مجموعتين ... واحدة تستخدم فى فصل المادة الوراثية DNA

و المجموعة الأخرى توضع فى محلول نسبت لمدة من 6 – 12 ساعة و منه الى محلول Hoyer’s

. على الشريحة التى توضع على ال Hot plateو ذلك لفحص العينات و التعرف عليها و رسمها. 

-4 حلم الدواجن  Dermanyssus gallinae

تم جمع العينات من مزارع الدواجن البياض فى محافظة المنيا و أيضا من مزارع الدواجن الشرقية فى كلية الزراعة – جامعة القاهرة و ذلك فى خلال الفترة من أغسطس 2003 الى يونيو  2004 .

و تم جمع الأفراد من على مخلفات الدواجن أسفل الأقفاص وأماكن وضع البيض.

و توضع العينات فى أنبوب بلاستيك و تغطى بقطعة من القماش الدمورو يكتب عليها  تاريخ جمع العينة و مكان جمع العينة و مكان الجمع و العائل.

و تنقل الى المعمل و توضع فى الحضان عل 27 – 30 °م و رطوبة 75 – 80% .

و يتم تقسيم العينات التى تم جمعها الى مجموعتين ... واحدة تستخدم فى فصل المادة الوراثية DNA

و المجموعة الأخرى توضع فى محلول نسبت لمدة من 6 – 12 ساعة و منه الى محلول Hoyer’s

. على الشريحة التى توضع على ال Hot plateو ذلك لفحص العينات و التعرف عليها و رسمها. 

الدراسة الهستوباثولوجية :

 دراسة تأثير الإصابات المختلفة بواسطة حلم الجرب زوروبتس كونيكيولاى   على جلد الأرانب.

تمت عدوى أرنب في المعمل بواسطة أنسجة مأخوذة من أرنب مصاب بالحلم السابق ذكره و أخذت أذن الأرنب المصابة بعد التخلص منة ووضعت فى فورمالين 5%  لمدة 24 – 48 ساعة ثم غسل بماء جارى لمدة 24 ساعة يمرر بعد ذلك على تركيزات الكحول: 70 , 80 ,90 , 96 , 100 % ثم يغمر فى زيلول و يزرع فى شمع بارافين ثم قطع بواسطةالميكروتوم على سمك 3 – 5 ميكرون و تصبغ بصبغة الهيماتوكسلين و الأيوسين و تحمل فى كندا بلسم و تفحص بواسطة الميكروسكوب الضوئي. 

ثالثا:

عزل و تنقية المادة الوراثية :DNA

تم عزل المادة الوراثية باستخدام بعض المركبات و المحاليل الكيميائية والأجهزة و التعرف على درجة نقائها باستخدام جهاز الأسبكتروفوتوميتر و جهاز الألكتوفوريسيس. 

أولا: القراد:

 من البيض.Rhipicephalus  sanguineus, Argas  arboreus , A. persicus  تم العزل للأنواع الثلاثة 

R. sanguineus                     البيض عمر 14-15 يوم

A. arboreus , A. persicus                                    البيض عمر 5-6 يوم       

ثانيا : الحلم المتطفل:

يتم عزل لمادة الوراثية من الفرد ككل. من الأنواع الثلاثة

Psoroptes cuniculi , P. natalensis and Dermanyssus gallinae 

 الدنا المتضاعف العشوائي  باستخدام PCR -RAPD

     تم دراسة و تحليل قطع الدنا المتضاعف العشوائي و الناتجة من المادة الوراثية لثلاثة أنواع من القراد و ثلاثة أنواع من الحلم باستخدام خمس بوادئ عشوائية و كل منها مكون من عشرة قواعد نيتروجينية. 

و من النتائج المتحصل عليها:

1- الدراسات البيولوجية:

القراد:

أ- Rhipicephalus sanguineus

تم جمع عدد 256 فرد من قراد الكلاب خلال الفترة من مايو إلى أغسطس 2002 من مناطق مختلفة فى محافظة القاهرة و الجيزة .

ب- Argas persicus

تم جمع عدد 630 فرد من قراد الدواجن خلال الفترة من ابريل إلى أغسطس 2002 من مزارع الدواجن التابعة لكلية الزراعة – جامعة القاهرة بالجيزة.

ت- Argas arboreus

تم جمع عدد 87 فرد من قراد أبو قردان خلال الفترة من أغسطس إلى ديسمبر 2002 و ذلك من الأشجار الكافور المحيطة لحديقة الحيوان بالجيزة .

الحلم:

أ- Psoroptes natalensis

تم جمع عدد 794 فرد من على الجاموس و ذلك فى خلال الفترة من شهر يونيو 2003 الى أغسطس 2004.و ذلك من المزرعة الشرقية لكلية الزراعة جامعة القاهرة ومنطقة كفر طهرمس. 

ب- Psoroptes ovis

تم جمع عدد 82 فرد من على  الخراف و الماعز من المزرعة الشرقية لكلية الزراعة جامعة القاهرة و العديد من الأسواق بمنطقة كفر طهرمس و ذلك في خلال الفترة من مارس الى أغسطس.

ت- Psoroptes cuniculi

تم جمع عدد 1274 فرد من على الأرانب في خلال الفترة من شهر مايو إلى نوفمبر 2003 و ذلك من المزرعة الشرقية و الغربية لكلية الزراعة جامعة القاهرة و مزرعة في طريق مصر الإسماعيلية.

ث- Dermanyssus gallinae

تم جمع عدد 964 فرد من مزارع الدواجن البياض في محافظة المنيا و أيضا من مزارع الدواجن الشرقية في كلية الزراعة – جامعة القاهرة و ذلك في خلال الفترة من أغسطس 2003 إلى يونيو  2004 و تم جمع الأفراد من على مخلفات الدواجن أسفل الأقفاص وأماكن وضع البيض. 

 1- الدراسات المورفولوجية:

1- Psoroptes cuniculi

     الأنثي:

تأخذ صفيحة genitl  شكل U  وطولها3,6 وعرضها ميكروميتر 2 ميكروميتر  بينما صفيحة epigynal  تكون طويلة و مسحوبة جهة وسط الجسم.

Genitl apodemes  تكون رفيعة و ملتوية إلى حد ما, و صفيحتي genital disces  يظهران بوضوح, القابلة المنوية ثلاثية الشكل.

     الذكر:

الصفيحة الشرجية بها زوج من الصفائح الصغيرة المستديرة , و زوج من الزوائد في نهاية الجسم كل منها لها خمس شعيرات.

2- Psoroptes ovis

      الأنثي:

    تأخذ صفيحة genitl  شكل U  وطولها 3 ميكروميتر وعرضها 2,4 ميكروميتر وهي واسعة من الوسط مستدقة النهاية , صفيحة epigenil  قصيرة و ملتوية, و صفيحتي genital disces  يظهران بوضوح, القابلة المنوية كآسية الشكل.

      الذكر:

الصفيحة الشرجية بها زوج من الصفائح الصغيرة, و زوج من الزوائد في نهاية الجسم كل منها لها خمس شعيرات. 

2- Psoroptes natalensis

تأخذ صفيحة genitl  شكل U  وطولها 3,2  ميكروميتر وعرضها2,4 ميكروميتر وهي عريضة, صفيحة epigenil  شبة منحرفة الشكل وعليها تخطيطات واضحة, و صفيحتي genital disces  يظهران بوضوح, القابلة المنوية مخروطية الشكل. 

الدراسات الهستوباثولوجية:

    الإصابة المعملية بحلم جرب الأرانب Psoroptes cuniculi  أثبتت حدوث تغيرات علي الأرنب و هي:

 حدوث أنتفاخات في الخلايا الحرشفية لطبقة الأبيدرمس و تجمع دموي يكون خرراريج و أورام و قروح و قشور لزجة كما أن بعض الأنسجة تبدو ميتة و خلايا طبقة الدرمس تبدو ميتة كما حدثت أنتفاخات و امتلاء الأوعية بالدماء و تخلل لخلايا الدم بالأنسجة و أعداد كبيرة جدا من بصيلات الشعر وحدوث نزيف في الجسم و موت العائل. 

 الدراسات الجينية:

تقنية الدنا المتضاعف العشوائي(RAPD):

القراد:

تم الحصول علي 90 باند من الخمس بوادئ , البادئ OPA-10  أعطى أعلي معدل باندات و هي 24 باند بينما البادئ OPA-15  أعطي أقل معدل باندات و هي 11 بندات , و كان الوزن الجذيئي للبندات يتراوح فيما بين 300 إلى 2250زوج قواعد.

-              البادئ OPA-09 : أعطي 18 باند وزنها الجزيئى يتراوح فيما بين <300 إلى 1600 زوج قواعد.

-              البادئ OPA-10 : أعطي 24 باند وزنها الجزيئي يتراوح فيما بين <300 إلى 1200زوج قواعد.

-              البادئ OPA-13 : أعطي 22 باند وزنها الجزيئي يتراوح فيما بين <300 إلى 2250زوج قواعد.

-              البادئ OPA-14 : أعطي 15 باندات  وزنها الجزيئي يتراوح فيما بين <300 إلى 1600 زوج قواعد.

-              البادئ OPA-15 : أعطي 11 باندات  وزنها الجزيئي يتراوح فيما بين 300 إلى 6000 زوج قواعد.

و قد تم استخدام هذة النتائج في التحليل للحصول علي صلة القرابة بين هذه الأنواع.

فكانت درجة التشابه بين كلا من:

Rhipicephalus sanguineus  و Argas persicus  كانت        50 %

Rhipicephalus sanguineus  و Argas arboreus  كانت        48 %

Argas persicus   و  Argas arboreus  كانت                          52% 

الحلم: 

تم الحصول علي 87 باند من الخمس بوادئ , البادئ OPA-09  أعطى أعلي معدل باندات و هي 24 باند بينما البادئ OPA-14  أعطي أقل معدل باندات و هي 8 بندات , و كان الوزن الجزيئي للبندات يتراوح فيما بين 300 إلى 6000 زوج قواعد .

-              البادئ OPA-09 : أعطي 24 باند وزنها الجذيئى يتراوح فيما بين 380 إلى 2000 زوج قواعد

-              البادئ OPA-10 : أعطي 22 باند وزنها الجذيئي يتراوح فيما بين <300 إلى 2000زوج قواعد.

-              البادئ OPA-13 : أعطي 21 باند وزنها الجذيئي يتراوح فيما بين 300 إلى 2500زوج قواعد.

-              البادئ OPA-14 : أعطي 8 باندات  وزنها الجذيئي يتراوح فيما بين 400 إلى 1800زوج قواعد.

-              البادئ OPA-15 : أعطي 12 باندات  وزنها الجذيئي يتراوح فيما بين 300 إلى 6000زوج قواعد.

و قد تم استخدام هذة النتائج في التحليل للحصول علي صلة القرابة بين هذه الأنواع.

فكانت درجة التشابه بين كلا من:

Psoroptes natalensis  و Dermnyssus gllinaae  كانت        41 %

Psoroptes natalensis   و Psoroptes cuniculi كانت            46 %

Psoroptes cuniculi  و Dermnyssus gllinaae  كانت           42 %

 

الخلاصة:

-              تم تجميع عينات من الحقل و دراستها معمليا و عمل مستعمرات للحصول علي أعداد من نفس النوع.

-              و التعرف علي الفروق المورفولوجية بين ثلاثة أنواع من الحلم من جنس زوروبتس.

-              أثبتت الدراسات تطابق الصفات المورفولوجية مع الفروق الجينية بين بعض أنواع القراد و بعض أنواع الحلم المتطفل.

-              كما أثبتت النتائج أن اسبة درجة القرابة بين الأجناس الواحدة أعلي منها من بين الأجناس المختلفة.

-              كما أثبتت النتائج أمكانية الأعتماد علي تقنيات البيولوجيا الجذيئية في تصنيف الأكاروسات المختلفة المعروفة و الغير معروفة."

93747                   ع550                     أحمد صلاح صلاح أحمد عبد الواحد       "تأثير التشبع بالموائع علي الخواص الصوتية

لصخور العصر الكريتاوي العلوي