دراسات علي بعض الفيروسات التي تصيب نباتات البطاطس في مصر

      رئيس بحوث متفرغ -قسم بحوث الفيروس والميكوبلازما , معهد بحوث أمراض النباتات , مركز البحوث الزراعية."                                   "هدفت هذه الدراسة الى توضيح العلاقة التعاونية بين فيروسين يصيبان نباتات البطاطس فى مصر وهما  فيروس Y البطاطس السلالة (N) وكذلك فيروس اوكيوبا البطاطس PAMV ولهذا تم عزل وتعريف الفيروسات من خلال دراسة:

(1) الخصائص البيولوجية والسيرولوجية للفيروسات المعزولة. (2) الفحص بالميكروسكوب الألكترونى للقطاعات النباتية المصابة بالفيروس. (3) استخدام اختبار البلمرة المتسلسل العكسى فى وجود البادئات المتخصصة لجين الغلاف البروتينى فى تعريف الفيروسات. كما تم اجراء التتابع النيوكليوتيدى أولا لجين الغطاء البروتينى لفيروسPVYN بالاضافة الى التتابع النيوكليوتيدى الكامل للحمض النووى RNA للفيروس بهدف: (1) التصنيف الدقيق للسلالة PVYN. (2) تأكيد بعض النتائج المتعلقة بالخصائص البيولوحية للفيروس وكذلك بالفحص بالميكروسكوب الألكترونى. (3) تفسير أنتقال السلالة حشريا وكذلك المساعدة لفيروس PAMV. بالأضافة الى أنتاج كمية كبيرة من البروتين الخاص بجين الغلاف البروتينى لفيروس PVYN من خلال عملية الكلونة والتعبير الجينى داخل خلايا بكتريا E. coli (BL 21).

ومن أهم الدراسات التى اجريت والنتا ئج المتحصل عليها :

1-            تم عزل وتعريف فيروسين من نباتات البطاطس المصابة طبيعيا فى الحقل (وهما فيروس Y البطاطس وفيروس اوكيوبا البطاطس(PAMV بمحافظات المنوفية والدقهلية على التوالى. صنفت عزلة PVY كسلالة PVYN  حيث تموت العروق على الأسطح السفلية للأوراق متبعا بموت الأوراق وذلك فى حالة نبات الدخان N. tabacum   صنف White Burley المصابة جهازيا بالفيروس.اما فيروس اوكيوبا البطاطسPAMV فعرف بيولوجيا أولا بأعادة الحقن ميكانيكيا على نباتات البطاطس صنف كارا المنزرعة فى الصوبة وقد أظهرت جهازيا مظهر الاوكيوبا المميز لهذا الفيروس. وقد سجل اصابتهما جهازيا لمعظم نباتات العائلة الباذنجانية فأ عطى PVY موزيك شديد على نباتات الفلفل صنف (كاليفورنيا وندر)  وموزيك على نباتات الحرنكش Ph. floridana . اما عزلة اوكيوبا قد تنوعت فى تفاعلها مع العوائل المختلفة حيث أظهرت بقع محلية وأعراض جهازية على كلا من نباتات الفلفل لأصناف (كاليفورنيا وندر& جوديون) ونباتات الطماطم أصناف (سترين ب & كاسل روك) وبعض العوائل الأخرى أظهرت أصابة جهازية فقط ومنها N. glutinosa   S. tuberosum L.  , N. benthamina أما   .L  N. tabacum أصناف (White Burley &Xanthi-nc) أظهر تفاعل جهازي بدون اعراض ظاهرية , كما لم يسجل اصابتها لنباتات مثلCost.Reyn. &D. metel L..Ch. amarnticolor

2-            أظهر التشخيص بأستخدام الأجسام المضادة المتخصصة لمعظم فيروسات البطاطس (PVX,PVY,PLRV,PVS,PVM,PVA) تفاعل ايجابى فقط مع الأجسام المضادة لفيروس Y البطاطس كما شخصت بالأجسام المضادة MAbs للسلالة N PVY فى العينات الموجبة لفيروسY بأستخدام الاليزا المباشرة بينما أظهر فيروس الاوكيوبا تفاعل سلبى مع الأجسام المضادة لفيروساتPVY,PVX,PLRV,PVS,PVM,PVA,TRV,AMV,ToRSV)) فى اختبار الاليزا المباشرثم تفاعل ايجابيا مع الأجسام المضادة لفيروس PAMV مما يؤكد عدم وجود علاقة سيرولوجية للفيروس مع فيروس PVX والذى يتبع نفس المجموعة.

3-            أنتقلت السلالة N PVY حشريا بواسطة حشرة من الخوخ الأخضر بنسبة 90% من نباتات الدخان المصابة بالفيروس بعد تغذية الحشرة لمدة 10 ق بطريقة غير باقية , أما فيروس  PAMV لم ينتقل بمفردة بحشرة المن السابقة من نباتات البطاطس المصابة, ولكن أنتقل بمساعدة فيروس PVYN بطريقة غيرباقية بعد تغذية المن اولا على مصدر من PVY لمدة (10 ق) ثم انتقالة للتغذية على مصدر لفيروس PAMV وكانت نسب الانتقال للفيروس هى صفر, 10, 10, 40, 60% بعد فترات تغذية 20ث, 40ث, 1ق, 5ق, 10ق على التوالى وهذا يؤكد أنتقال الفيروس فى الحقل بواسطة النقل الحشرى بعد تغذية حشرة من الخوخ الأخضر على مصدر من الفيروس المساعد PVY وهذا يفسر دور الغطاء البروتينى مع الجين المتخصص helper component لفيروس PVYN فى نجاح النقل الحشرى لفيروس اوكيوبا البطاطس.

4-            أظهر الفحص بالميكروسكوب الالكترونى وجود الأجسام المحتواة الداخلية فى السيتوبلازم المميزة لمجموعة potyvirus على هيئة محتويات اسطوانية Pinwheel مع تجمعات صفائح بروتينيةLaminated aggregates وتجمع الفيروس فى أشكال بللورية مع ملاحظة وجود الأجسام الأمورفية وذلك عند فحص أوراق نباتات الداتورة المصابة (36 يوم بعد الحقن الميكانيكى). اما فيروس الاوكيوبا اظهر وجود أجسام تأخذ شكل مغزلى spindle-shaped وهى عبارة عن تجمع من جزيئات الفيروس بداخل السيتوبلازم فى القطاعات الطولية والعرضية وذلك فى نباتات البطاطس المصابة ,كما أظهر الفيروسين تغيرات فى الكلوربلاست و الميتوكندريا .

5-            تم عزل وتعريف جين الغلاف البروتينى لكلا من فيروس Y البطلطس وفيروس اوكيوبا البطاطس باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل العكسى (RT-PCR) من الأوراق المصابة وكان ناتج التفاعل 801 &892 bp على التوالى.

6-            وجد من دراسة التتابع النيوكلوتيدى لجين الغطاء البروتينى لسلالة PVYN  أنة يتكون من801 نيوكلوتيدة وأعطت نسبة قرابة اكبر من99 % مع السلالة Fr–PVYN (الفرنسية), يليها PVYO& PVYC وأخيرا سلالة PVYNTN وذلك عند أجراء مقارنة للسلالة المصرية مع السلالات الأخرى للفيروس المسجلة ببنك الجينات. كما أظهرت العزلة Potato-US نسبة قرابة عالية (97.4%) مع السلالة المصرية وقد تراوحت نسب القرابة من 59.9الى 63.2% مع فيروسات عائلة potyviridae. كما ثبت وجود التتابع الأمينى الثلاثي DAG (اسبارتيك-الانين- جليسين) عند الطرف الأمينى للبروتين وهو المسئول عن النقل الحشري للسلالة المصرية, أما الطرف الكربوكسيلى فهويحتوى على  19 حمض امينى لها دور فعال فى تحديد الصفة الانتيجينية لجين الغطاء البروتينى. اما خاصية Hydrophilicity لجين الغطاء البروتينى فقد وجد ارتباطها بالأحماض الأمينية الأتية: الانين- ايزوليوسين- ليوسين- فينيل الانين- تريبتوفان- فالين- سيستين- جليسين- ميثيونين- تيروزين- هيستدين- ليسين- ثيرونين والتى يبلغ عددها الكلى 161 حمض امينى والتى ترتبط بالصفة الانتيجينية للبروتين بجانب خاصية التفافة عند مرحلة تكوين التركيب الثنائى.

7-            تم دراسة التتابع النيوكلتيدى لجينوم فيروس PVYN وقد سجلت فى بنك الجينات تحت رقم (#AF52296) واوضحت النتائج الأتى: (أ)  ان جينوم الفيروس يتكون من اثني عشر جين وترتيبهم النيوكلتيدى كالاتى :

5`-UTR  (0-184)   →P1 (185-1009) →   HC-Pro (1010-2656) →  P3 (2657-3499) →

6K1 (3500-3656) →CI (3657-5557) →6K2 (5558-5713) →NIa-VPg (5714-6277) →

NIa- Pro (6278-7009) →NIb (7010-8572) →CP (8573-9373) →3`-UTR (9374-9704)

ويحتوى الجينوم على 9704 نيوكلوتيدة(متضمنة الجينات الغير مترجمة) وهى تحتوى على 95¸30 % ادينين , 73¸18% سيتوزين ,41¸23% جوانين  89¸26% ثيمين .

(ب)- يبدأ ORF الخاص با لبروتين عند موقع  النيوكلوتيدة 185ATG بالحامض اللأمينى ميثيونين  وينتهى عند النيوكلتيدة 9373 بشفرة النهاية  TGA عند نهاية البروتين وبذلك ينتج الببتيدات العديدة للفيروس عبارة عن قطعة واحدة من ORF يبلغ طولها 3063 حامض امينى .

(ج)- كانت نسبة القرابة اكبر من9¸99 % مع السلالة PVYN-Fr (الفرنسية) وهذا يؤكد قرابة السلالة المصرية الى السلالة النكروزية لفيروس Yالبطاطس ويليها السلالة الكندية  PVY-Caبنسبة2¸96% بينما أظهرت السلالاتPVY-Hu PVY-Sw نسب قرابة 4¸84 , 8¸84 %  على التوالى.

(د)- يبلغ طول 5`-UTR 184 نيوكلتيدة وقد وجد أحتوائها على منطقتين محافظتين هما أ- (acaacat) عند الموقع 18–24 والأخرى ب- tcaagca)) عند الموقع 67- 73 وهذة التتابعات تكون خاصة بفيروس PVY ولها دور فى دورة حياة الفيروس. اما البروتين الخاص بجينP1 فقد وجد انة يحتوى على منطقتين محافظتين MSTI (ميثيونين- سيرين- ثيرونين- ايزوليوسين) عند الطرف الامينى للبروتين والاخرى FIVRG (فينيل الانين- ايزوليوسين- فالين- ارجنين - جليسين) عند نهاية الطرف الكربوكسيلي للبروتين . اما بداخل جين Hc-Pro وجد منطقتين محافظتين بالقرب من الطرف الامينى للبروتين هما :

·             منطقة "" Zinc-finger ""  وهى خليط من تتابع الحمضين الأمينين سيستين, هستدين ولها دور فى تحديد أصابة الفيروس ويليها تتابعى   PTK (برولين- ثيرونين- ليسين) &   KITC (ليسين- ايزوليوسين- ثيرونين- سيستين) المسئولتين عن النقل الحشرى لفيروسN Y وكذلك المساعدة فى النقل الحشرى لفيروس PAMV وهذا يؤكد على ان معظم البروتينات الخاصة بالفيروس لها وظائف عديدة فى دورة اصابة الفيروس.

(ﻫ)- تراوحت نسب القرابة بين 7¸47-  8¸51% مع فيروسات عائلة potyviridae وأعلى نسبة قرابة كانت مع فيروسvirus  .pepper mottle

(و)- بدراسة التقسيم على أساس النهاية 5` والمتضمنة لجين 5`-UTR &P1وكذلك جين CPعند النهاية 3` اثبت وجود قرابة وثيقة بين السلالة PVYN-Egypt الى فيروس PVY-Canada  والتى تنتمى الى السلالة O وهذا يماثل نتائج التحليل الجينى الكامل للسلالة بمقارنتها بالسلالة المصرية  ويرتبط  بعرض الموزيك على نبات البطاطس وبدراسة جين 3`-UTR انتقلت القرابة فى مجموعة واحدة مع السلالة النيكروزية الفرنسية وكذلك مع السلالة السويسرية PVY-Swiss والتى تنتمى الى تحت مجموعة PVYNTNمما يؤكد ارتباط هذا الجين بتحديد الأعراض على نبات الدخان .

8 - تم أنتاج البروتين الخاص بجين الغطاء البروتينى لفيروسPVYN داخل بكتريا E. coli (BL21) من خلال:

ط             ادخال جين الغطاء البروتينى للفيروس المعزول بواسطة اختبار RT-PCR داخل بلازميد PinPoint™ Xa-1 بعملية ligation ,ثم اكثار البلازميد بداخل البكتريا بعد عملية transformation .

ط             عزل DNA البلازميد من داخل المستعمرات البكتيرية والتأكد من احتوائها على الجين فى الاتجاة الصحيح in frame بأختبار القطع الأنزيمى بواسطة Bgl II& BamH I  واختبارة بأستخدام البادئات المتخصصة للغطاء البروتينىOS1,OC1  بأختبار PCR .

ط             اجراء التعبير الجينى (الترجمة) بواسطة  µM biotin IPTG &2  µM 100  والتحضين لمدة 4 ساعات/37 º م والتى تؤدى لانتاج biotinylated protein خاص ببكتريا E. coli ذو وزن جزيئى 22.5 KDa وكذلك انتاج fusion protein  ذات وزن جزيئى  (~48 KDa) تتكون من biotin tag للبلازميد والفيروس.

ط             اجراء تنقية للبروتينلت المعلمة با لبيوتين بخاصية affinity purification بواسطة مادة soft link™ soft release avidin resin والتى تعمل على ارتباط fusion protein  تاركا بروتين E. coli  غير مرتبط مع avidin للحصول على تنقية عالية التخصص لأنتاج الغلاف البروتينى للفيروس, ثم تحضين البروتين مع محلول البيوتين  5mM والذى يعمل على تكسير معقد avidin-biotin منتجا بروتين الفيروس تحت ظروف لا تسمح بتغيير طبيعتة وكان ناتج التنقية هو 85 و2ملليجرام/ مل."