دراسات على الفاعلية و التوصيف الجزيئي لبكتريا الباسيلس ثورينجيانسس المعزولة من حشرات القطن حرشفية الأجنحة و من التربة في مصر

                                                "استهدفت هذه الدراسة تحديد تواجد و توزيع بكتريا الباسيلس ثورينجيانسس في التربة المصرية وكذلك توصيف عزلات محلية ذات فعالية عالية ضد حشرات حرشفية الأجنحة (دودة ورق القطن- دودة اللوز الأمريكية- دودة اللوز القرنفلية- الدودة القارضة).

في إطار ذلك تم تجميع عدد 97 عينة تربة من حقول القطن المزروعة في أماكن مختلفة ممثلة لإحدى عشر محافظة هي: الشرقية-الغربية-المنوفية-القليوبية-الدقهلية-كفر الشيخ-البحيرة-بنى سويف- المنيا-الجيزة.

أوضحت الدراسة انه تم عزل عدد 96 عزلة جديدة من بكتريا الباسيلس ثورينجيانسس من مجمل 2618 عينة فحصت خلال الدراسة أي بنسبة 3.67 ٪ . تم تحليل بعض الخواص  الطبيعية  والكيميائية لعينات التربة التي تم جمعها بهدف إيجاد علاقة بين هذه الخواص وتواجد بكتريا الباسيلس ثورينجيانسس  في التربة المصرية. ولقد اشتملت دراسة هذه الخواص على : نوع التربة -  قياس الأس الهيدروجيني -  نسبة الملوحة – نسبة المادة العضوية –  نسبة النيتروجين الكلى – ¬نسبة النحاس الموجودة في هذه العينات. 

وقد شملت الدراسة أيضا محاولة عزل بكتريا الباسيلس ثورينجيانسس من حشرات مريضة من رتبة حرشفية الأجنحة وتم التجميع من نفس الحقول  التي تم تجميع عينات التربة منها. واشتمل ذلك على تجميع 36 عينة حشرية وفحص 857 عزلة حيث تم الحصول على عدد 6 عزلات فقط من بكتريا باسيلس ثورينجيانسس بنسبة 0.7 ٪ .

بعد ذلك تم  تحضير 45 مزرعة من العزلات السابق الحصول عليها من عينات التربة والحشرات المريضة , باستخدام طريقة (1998  Morris et al.,) و أظهرت النتائج الخاصة بهذه العينات أن قيمة الآس الهيدروجيني لهذه العزلات كانت قلوية  تراوحت بين 8.36 –9.11 وسجلت اكبر قيمة عند 9.11 للعزلة Mnof.2. كذلك وجد أن أعلى قيمة قدرت لوزن الناتج النهائي لعملية التخمر كان 9.5 جم / لتر للعينة Kalu.4 يليها Shar.5,     Ghar.3  ,  Dkah.2بقيم تتراوح  بين 9 - 9,25 جم / لتر . كذلك وجد أن قيم الكثافة الضوئية(O.D.) تراوحت بين 1.3- 3.4 , حيث سجلت أعلى قيمة 3.4 للعينة Ghar.4 وأقل قيمة للعينة Shar.3.

تم تقييم فاعلية هذه العزلات (45 عزلة) ضد يرقات حديثة الفقس لدودة ورق القطن و دودة اللوز الأمريكية و دودة اللوز القرنفلية و الدودة القارضة عند تركيز 500 ميكروجرام / مل و أوضحت النتائج أن نسبة الإماتة لدودة ورق القطن تراوحت بين 20 – 87 ٪ بينما تراوحت بين  18 – 82 ٪ لدودة اللوز الأمريكية تراوحت النسبة بين  19 – 89 ٪لدودة اللوز القرنفلية وللدودة القارضة تراوحت النسبة بين  10 – 54 ٪ .

حيث استخدمت ثلاث عزلات مرجعية هي HD-635، دايبل، أجرين بهدف قياس فاعلية العزلات الجديدة ضد عزلات مرجعية معلومة القوة كالآتي:

1-            أجرين ودايبل كعزلات مرجعة الدودة اللوز الأمريكية والقرنفلية.

2-            HD- 635 كعزلة مرجعية لدودة ورق القطن.

3-            HD- 635 ودايبل كعزلات مرجعية  للدودة القارضة.

وتبين من  النتائج أن العزلة Shar.5  كانت فعالة ضد يرقات دودة ورق القطن وكانت الجرعة نصف المميتة 103.5 ميكروجرام/ مللي وبفاعلية 26900 ميكروجرام / الوحدة الدولية بالمقارنة مع العزلة المرجعية HD-635 . أما في حالة العزلة Dkah.1 كانت فعالة ضد يرقات دودة ورق القطن وكانت الجرعة نصف المميتة 127.74 ميكروجرام/ مللي وبفاعلية 102676 ميكروجرام / الوحدة الدولية بالمقارنة مع العزلة المرجعية HD-635 

وبالنسبة ليرقات دودة اللوز الأمريكية فقد كانت الجرعة نصف المميتة 114.67 ميكروجرام/ مللي وبفاعلية 36229 ميكروجرام /الوحدة الدولية بالمقارنة مع العزلة المرجعية Dipel 2X  وبفاعلية 42237 ميكروجرام/ الوحدة الدولية مقارنة للعزلة المرجعية Agerin®.  أما في حالة العزلة  Dkah.4 كانت فعالة ضد يرقات دودة اللوز الأمريكية وكانت الجرعة نصف المميتة 119.28 ميكروجرام/ مللي وبفاعلية 43941 ميكروجرام /الوحدة الدولية بالمقارنة مع العزلة المرجعية Dipel 2X و 40606.3 ميكروجرام/ الوحدة الدولية مقارنة للعزلة المرجعية Agerin® .

أما بالنسبة ليرقات دودة اللوز القرنفلية فقد كانت العزلة Kalu.6 فعالة وكانت الجرعة نصف المميتة 79.75 ميكروجرام/ مللي وبفاعلية 81001 ميكروجرام /الوحدة الدولية بالمقارنة مع العزلة المرجعية  Dipel 2X و65134 ميكروجرام/ الوحدة الدولية مقارنة بالعزلة المرجعية Agerin®.  وسجلت العزلة Beni.3 أيضا فاعلية ضد يرقات دودة اللوز القرنفلية وكانت الجرعة نصف المميتة 133.88 ميكروجرام/ مللي وبفاعلية 48252ميكروجرام /الوحدة الدولية بالمقارنة مع العزلة المرجعية   Dipel 2X و 38800 ميكروجرام/ الوحدة الدولية مقارنة بالعزلة المرجعية Agerin® .

وقد تم دراسة التغيرات  الهيستوباثولوجية في كل من دودة ورق القطن ودودة اللوز القرنفلية باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني الماسح والنافد.

تناولت دراسة الميكروسكوب الإلكتروني الماسح تأثير بكتريا الباسيلس ثورينجيانسس على الجزء السطحي للخلايا المبطنة المعي المتوسط. أظهرت العزلة  Shar.5 تأثيرا واضحا  على خملات الامتصاص الخاصة بالخلايا الطلائية (microvilli) حيث ظهرت في العينات المعاملة بشكل غير منتظم ومتهتكة بالإضافة إلى صغر حجم الخلايا. و كذلك أوضحت العزلة Kalu.6 ذات الفاعلية العالية ضد دودة اللوز القرنفلية اختراق الخلايا الخضرية للبكتريا إلى داخل نسيج المعي المتوسط وأظهرت تهتك واضح   لخملات الامتصاص الخاصة بالخلايا الطلائية (microvilli) .

ومن الفحص الميكروسكوبي لتأثير عزلة Shar. 5 على دودة ورق القطن تبين ما يلي:

1-            التأثير على العضلات المحيطة بالمعي المتوسط حيث فقدت شكلها الطبيعي ورافق ذلك ظهور ليسوسومات مرتبطة بها

2-            زيادة تعرجات الغشاء القاعدي المغلف للخلايا الطلائية .

3-            وجود فجوات بين الخلايا العمادية والكأسية المكونة للنسيج الطلائي و كذلك داخل سيتوبلازم الخلايا.

4-            تبعثر الـ microvilli وتقطعها وظهورها في حالة متدهورة و رافق ذلك ظهور بعض Lysosomes.

5-            عدم انتظام وتقطع العشاء النووي المغلف للنواة مع تراكم الريبوسومات داخل النواة.

6-            زيادة كثافة السيتوبلازم الخاص بالخلايا الكأسية وكذلك اتساع الفجوة الكأسية مع فقدانها النتؤات السيتوبلازمية الداخلية.

بينما اشتمل تأثير Kalu.6 على المعي المتوسط لدودة اللوز القرنفلية ما يلي:

1-            ظهور خملات الامتصاص الخاصة بالخلايا الطلائية ( microvilli ) في حالة ومتهتكة وانفصالها التام عن باقي النسيج وكانت الخلايا البكتيرية مرافقة لهذا.

2-            انتشار الفجوات  الليسوسومات على مستوى الخلايا.

3-            وأظهرت النواة شكل غير منتظم مع زيادة كثافة الكروماتينات في الداخل .

امتدت الدراسة لتشمل التوصيف الجزيئي لتسع عزلات من البكتريا ذات فاعلية عالية وأخرى غير فعالة ضد الحشرات المستخدمة إضافة إلى العزلات المرجعية باستخدام بعض التقنيات الحديثة مثل التفريد الكهربي للبر وتينات ((SDS-PAGE واستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل باستخدام بوادئ متخصصة لبعض الجينات الخاصة بالبروتين البلوري للعزلات       ((Specific-PCR وكذلك استخدام تقنية البصمات الوراثية باستخدام بوادئ عشوائية للتمييز بين العزلات المختلفة ((RAPD-Fingerprinting .

أظهرت النتائج الخاصة بالتفريد الكهربي للبر وتينات أنه يمكن التمييز بين العزلات وربط ذلك بنتائج التجارب الحيوية. حيث أظهرت العزلات ذات الفاعلية العالية ضد دودة ورق القطن باند عند 141 كيلو دالتون مميزة لهذه العزلات فقط بينما اشتركت مع العزلة المرجعية (HD-635) في 127، 64، 60 كيلو دالتون أما بالنسبة للبر وتينات ذات القيمة الصغيرة فأظهرت باندات مميزة لتلك العزلات تراوحت بين 32-76 كيلو دالتون. بالنسبة للعزلات Kafr.1, Dkah.4 ذات الفاعلية العالية ضد دودة اللوز الأمريكية فقد أظهرت باند عند 104، 178 مميزة فقط لهذه العزلات بينما اشتركت مع العزلات المرجعية في باندات تتراوح بين 25-73 كيلو دالتون وأوضحت النتائج حول العزلات الفعالة ضد دودة اللوز القرنفلية اشتراكها مع العزلات المرجعية في باندات  بروتين تراوحت بين 25-73 كيلو دالتون كبر وتينات ذات وزن جزئيي صغير، بينما اشتركت بعضها عند 135 كيلو دالتون كبروتين ذو وزن جزيئي كبير.

وأوضحت الدراسة إمكانية استخدام الـ RAPD-PCR في تقديم صورة واضحة للتمييز بين العزلات باستخدام بوادئ عشوائية.

وأخيراً أجريت تجارب معملية لإنتاج العزلة Shar.5 باستخدام مخمر 5 لتر.وقد درست الكثافة الضوئية (O.D)، معدل التقليب و قيمة الأس الهيدروجيني ومعدل التهوية خلال عملية التخمر وقدرت كمية الناتج من البكتريا بحوالي 8.5 جم/ لتر."