دراسات على التحسين الوراثى لبعض أصناف القطن المصرى بإستخدام طرق التقنية الحيوية الحديثة

                                  "الملخص العربى

يعتبر القطن من المحاصيل الهامة حيث تأتى أهميته الأقتصادية من كونه النبات النسيجى الأول فى العالم كما يعتبر مصدر هام لإنتاج الزيوت ، ويعتبر القطن المصرى  Gossypium barbadense L. واحد من أهم المحاصيل فى مصر حيث يشتهر عالمياً بجودة وطول التيلة. ومن المعروف أن تكاليف زراعة القطن قد زادت نتيجة للزيادة المطردة فى إستخدام المبيدات الحشرية ، كما أن هناك أتجاه لتقليل إستخدام هذه المبيدات نتيجة للأضرار البيئية الجسيمة التى تسببها والنقص الواضح فى كفاءتها فى القضاء على آفات القطن.

العناصر المتنقلة من النوع Retrotransposons هى الأكثر وجوداً وإنتشاراً فى الجينوم النباتى ، وقد وجد أن الفيروسات العكسية والعناصر المتنقلة النباتية تشترك فى دورة حياة خلوية متماثلة وبما فى ذلك التشفير للبروتينات الرئيسية ، وبالرغم من ذلك فإن العناصر المتنقلة تفتقر الى الجين env الهام لإحداث العدوى الفيروسية والقدرة علي التنقل من خلية الي أخري وكذلك الأندماج داخل الجينوم ، وقد وجد أن العناصر المتنقلة النباتية تتميز بتنوع شديد فى مواقعها الوراثية المتعددة داخل الجينوم النباتي وبالمثل تتابعها النيوكليوتيدى والذى يعكس مدي تطورها علي المدي الزمني الطويل. ومن المعروف أن الفيروسات الرجعية من أهم الكائنات المستخدمة حاليا في نقل الجينات وعلي ذلك فتحديد تركيب بعض المشابهات النباتية للفيروسات الرجعية من حيث تركيبها ونشاطها الجيني يعزز إمكانية عمل الفيروسات النباتية الرجعية كأدوات نقل جينية فعالة لنقل الجينات بين الأنواع النباتية المختلفة. 

الهدف الرئيسي لهذه الدراسة هو دراسة العناصر المتنقلة النباتية من النوع Gypsy وإستخدامها لتحسين نبات القطن من خلال التعامل المباشر مع الجينات والذى يمكن أن يؤدى للحصول على تحسينات وراثية لا يمكن إحداثها من خلال برامج التربية التقليدية ، فوجود ناقل معتمد على العناصر المتنقلة النباتية من النوع Gypsy يمكن أن يمثل أداة هامة لإنتاج نباتات قطن محولة وراثياً واضحة من حيث أن المادة الوراثية المدخلة يتوفر بها شرطا الأمان الحيوى بالاضافة الى الجدوى الأقتصادية ، علماً بأن طرق التحول الوراثى المتاحة حالياً ذات تكلفة عالية وتستهلك الكثير من الوقت والجهد. 

النتائج:

1.            تم إختبار مدى سلامة المادة الوراثية المستخلصة وذلك عن طريق تكبير الجين 18S rRNA بواسطة التفاعل البلمري المتسلسل وتم التأكد من أن المادة الوراثية تحت الإختبار سليمة وملائمة للدراسات التالية.

2.            إستخدام بادئات متخصصة لجينات الـGypsy الخاصة بالدروسوفيلا أظهرت أن الأقطان المصرية وآبائها تمتلك تتابعات مشابهه لجينات الفيروسات العكسية gag, pol, env. علاوة على ذلك فإن هذه التتابعات توجد فى جنس الـ Gossypium فى تركيب معقد كدليل على التنوع فى أوزانها الجزيئية.

3.            البادئات المتخصصة للجين env الخاص بالـGypsy فى الدروسوفيلا أعطت تتابع طوله حوالى 320 زوج من القواعد فى الأقطان المصرية وآبائها. ومن الملاحظ أن هذا  الجزء المكبر مقارب فى الوزن الجزيئى لذلك الموجود فى الدروسوفيلا.

4.            عند مقارنة التتابعات النيوكليوتيدية مع تلك الموجودة فى قاعدة بيانات بنك الجينات على شبكة الإنترنت دل على طبيعة الجين env فى النواتج المكبرة فى الأقطان المصرية وآبائها. وعلاوة على ذلك فإن توقع تتابعات الأحماض الأمينية أوضح بشدة إمكانية وجود غشاء بروتينى ممتد والذى يدرس كأحد العناصر الموجودة فى جينات الـenv  الخاصة بالفيروسات الرجعية.

5.            تم مقارنة التتابعات النيوكليوتيدية والأحماض الأمينية لحيز الجين env الموجود فى الأقطان المصرية وآبائها وقد أظهر أن هذه التتابعات ذات تشابه جزيئ.

6.            عند مقارنة درجة التماثل فى التتابعات النيوكليوتيدية بين الأصناف المصرية للنوع barbadense  G. (أشمونى -  دندرة - جيزة45 - جيزة90) فى مقارنة مع السلالة A2 - 132 للنوع G. arboreum وجد أن درجات التماثل كانت 72%, 64%, 70%و 62% على التوالى بينما عند أجراء نفس المقارنة مع السلالة D5 - 1 للنوع G. raimondii وجد أن نسب التماثل كانت 91%, 80%, 83%و 83% على التوالى.

7.            عدد مرات الإستبدال (substitutions) داخل منطقة العامل الوراثى env في النيوكليوتيدات المتشابهة والغير متشابهة  (Synonymous (S) & (Nonsynonymous (N)  تم دراستها. حيث وجد أن النسبة بينهما توضح أن التطور الجزيئي للعامل الوراثي  env  داخل الجينوم الخاص بنبات القطن المصري    G. barbadense L. تم تحت ضغط إنتخابى إنتقائى   Purifying selectionمما يوضح أهمية هذا الجين.

8.            العلاقات التطورية فى جينات الـenv بين النوع L. G. barbadense والكائنات الأخرى تم تحديدها وذلك من خلال مقارنة التتابع النيكلوتيدي الخاص وقد وجد أن أقرب العوامل الوراثية المشابهة هو العامل الوراثىPigy  الموجود في نبات البسلة     (Pisum sativum) وقد وجد أيضا أن هذه العوامل الوراثية تمثل تطورا أحادى المنشأ (monophyletic origin) ، وقد نشأت تطوريا تحت ضغطاً وظيفياً موضحاً الدور المهم في التطور الوراثي لهذه الجينات داخل جينوم نبات القطن المصري.

9.            تم تحديد نواتج نسخ الجين env المفترض فى القطن وذلك بإستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل ذو النسخ العكسى RT - PCR مما يقترح بأنها ذات نشاط نسخى. 

                                والخلاصة أن هذه الدراسة أظهرت أن الأقطان المصرية وآبائها تحوى تتابعات مشابهه للتتابعات الفيروسية الخاصة بالفيروسات العكسية ، وهذه النتائج تقترح أن هذه التتابعات تعتبرمكون أساسي فى الجنس Gossypium وعلاوة على هذا فإن إنتشارها الواسع وتحديد نواتجها النسخية أوضحا دورها النشط فى جينوم الجنس Gossypium ودعم الحقيقة بأن هذه التتابعات توجد كمكون رئيسى فى التركيب الوراثى للنبات. 

                                البيانات التى يتم الحصول عليها من خلال تجارب عديدة لدراسة هذه التتابعات مثل تحديد تكراراتها وتوزيعها الكروموسومى وكذلك تتابعات المناطق المتجاورة الكبيرة لجينوم الجنس Gossypium سيضيف للمعلومات الأساسية أضافة قوية عن دور مثل هذه التتابعات فى شكل وتطور جينوم الجنس Gossypium. ووجود ناقل معتمد على العناصر المتنقلة النباتية المحتوية الجين env يمكن أن يمثل أداة هامة لإنتاج نباتات قطن محولة وراثياً واضحة من حيث أن المادة الوراثية المدخلة يتوفر بها شرطا الأمان الحيوى بالاضافة الى الجدوى الأقتصادية ، علاوة على ذلك فإن التوسع فى إستخدام العناصر المتنقلة النباتية كناقلات للجينات يمكن أن يمثل إضافة كبرى لعمليات النقل الجينى بدون الحاجة لإستخدام طرق التحول الوراثى المتاحة حالياً. وبعكس الحيوانات فإن النباتات بها خصائص هامة تميزها مثل قدرتها على التكاثر خضرياً حتى ولو من خلية واحدة. وكما هو الحال بالنسبة الى مشابهات الفيروسات الرجعية فإن العناصر المتنقلة النباتية ذات التضاعف الكافي من الضروري دراستها لتحديد وظيفتها الهامة ولفهم كيف أن هذه العناصر المتنقلة النباتية تسهم بصورة طبيعية فى إنتقال الجين بين الاصناف وكذلك لدراسة نسبة التطوير فيما يتعلق بإستخدام أنواع المحاصيل المحورة وراثياً. كذلك الإستفادة من هذه الدراسات لمحاولة علاج حالات الإصابة بالفيروسات الرجعية الممرضة داخل المملكة الحيوانية.             

SUMMARY

The major aim of this work is to employ gypsy group retrotransposons for cotton improvement, through direct manipulation of genes, which can produce improvements not possible through classical breeding programs. A vector based on gypsy group retrotransposons could be an important additional tool for the production of transgenic cotton plants with well-defined, foreign DNA inserts required for biosafety approval and commercialization. Currently available transformation methods that are expensive, time consuming, laborious, idiosyncratic, and therefore difficult to automate.

Results:

1.            The integrity of the genomic DNA was examined by amplifying the 18S rRNA gene. The detection of expected amplicon for 18S rRNA indicates the integrity of cotton genomic DNA. In other words, the purified DNA is intact and suitable for further studying.

2.            The employment of specific primers for the Drosophila gypsy genes revealed that the Egyptian cottons and their progenitors harbor retrovirus-like sequences for gag, pol and env respectively. Furthermore, these sequences exist in Gossypium in a complex structure as evident to their variable molecular weights.

3.            Specific primers for the Drosophila gypsy env gene produced an amplicon of approximately 320 bp in the Egyptian cottons and their progenitors. It is noteworthy that this amplicon is similar in molecular weight with its counterpart in Drosophila.

4.            Comparative nucleotide and amino acid sequences with the GenBank database (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) confirmed the env-like nature of the amplified products in the Egyptian cottons and its progenitors. Furthermore, their predicted amino acid sequences strongly predicted the presence of hydrophobic membrane spanning helices that are considered diagnostic motifs found in the retroviral env genes.

5.            Comparative nucleotide and amino acid sequences of the env-like domain in the Egyptian cottons and its progenitors revealed these sequences are heterogeneous.

6.            Comparative nucleotide sequences similarity between the G. barbadense cultivars (Ashmouni, Dendra, G45 and G90) in comparison with G. arboreum strain A2-132 were 72, 64%, 70% and 62% respectively. On the other hand, 91%, 80%, 83% and 83% respectively with G. raimondii strain D5-1.

7.            Synonymous and nonsynonymous nucleotide substitutions (dS/dN) in the putative env domain of the cotton sequences were investigated. The synonymous and nonsynonymous ratio (nucleotide substitutions (dS/dN) is 0.977±0.020, therefore, high enough to infer that the env domain in G. barbadense L. has been under purifying selection.

8.            Evolutionary relationships among G. barbadense env-like genes and other organisms were assessed. Phylogenetic analysis provided strong bootstrap support for a monophyletic origin of plant env-like domains, yet showed high diversity within all species and cultivars. Cotton env-like sequences have the strongest affinity with the env-containing retrotransposon Pigy of Pisium sativum.

9.            Putative cotton env-encoded transcripts were detected in their related respective seeds using RT-PCR, suggesting their transcriptional activity.

In conclusion, the current study revealed that the Egyptian cottons and their progenitors contain retroviral-like sequences. These results suggest that retroviral-like sequences are a standard component of the Gossypium genome. Furthermore, their wide distribution and detection of their encoded transcripts illustrate their active role in the Gossypium genome, and supporting the fact that these sequences represent a major component of the plant genome. Further experimental data such as copy number determination, chromosomal distribution, and sequencing of large contiguous regions of the Gossypium genome will significantly add up fundamental knowledge about the role of retroviral-like sequences in shaping and evolution of the Gossypium genome.

A vector based on plant env-containing retrotransposons could be an important additional tool for the production of transgenic plants with well-defined, foreign DNA inserts required for biosafety approval and commercialization. Furthermore, the development of plant retrotransposons as gene vectors is of great advantage to transfer genes of interest without using currently available transformation methods. Unlike animals, plants do not sequester their germ line and the potentially infected somatic plant cells can give rise to floral organs and seeds. In this context, the identification of a replication-competent plant retrovirus is imperative to determine its functional significance, and to understand how plant retrotransposons naturally contribute to interspecies gene flow, and thus rationally evaluate recent concerns regarding the use of genetically modified crop species. Finally, elucidate the unique biology of plants that has helped to restrict the pathogenicity of retroviruses within the animal kingdom."