دراسات جزيئية عن بعض الأمراض الفيرودية التى تصيب الموالح فى مصر "Prof. Dr. Abd El Hammid Sabek Professor of virology Viruses and Mycoplasma Research Depart. Plant Pathology Research Institute. (A.R.C) Prof.Dr.Ahmed Barak

 "الملخص العرب

تعتبر الموالح من أهم المحاصيل الآقتصاديه الهامه فى العالم و فى منطقه حوض البحر الأبيض المتوسط و البلاد العربيه بصفه خاصه،حيث أنها تدخل فى كثير من الصناعات الهامة و ذلك للقيمه الغذائية العالية الا أنها تتعرض للعديد من الأمراض أهمها الأمراض الفيروسيه والشبه فيروسيه .  و قد وجد أن زراعات الموالح فى مصر تصاب  بأغلب  الفيرويدات المعروفه  و من أخطرها فيرويد تشقق قلف الترايفولياتا (CEVd) و فيرويد مرض تلون خشب التانجلو اورلندو و اليوسفى أو الكاككسيا (CCaVd) و نظرا للأصابة الشديدة لزراعات الموالح فى مصر و العالم و خاصة حوض البحر الأبيض المتوسط فلقد أهتم الباحثين بدراسة هذين المرضين الا أن صعوبة التشخيص و التعرف عليهما بدقه بالطرق التقليديه عن طريق التعرف على الأعراض الظاهريه على نبتات  الأختبار الحساسه لكل نوع من هذه الفيرويدات, كان من أهم العوامل الرئيسيه لأجراء الدراسات عليها بهدف دراسة هيكل و خواص الفيرويد الجزيئيه و محاولة تطوير طرق تشخيص الفيرويد و كذلك توظيف التقنيات الحديثه لأستخدامها فى التعرف على الفيرويد.

و لدراسة البيولوجيا الجزيئية لهذة الفيرويدات فقد تم اسنخدام اسرع و ادق التقنيات الحديثة و أكثرها حساسيه و هى التفاعل أنزيم البلمره المتسلسل والهجره الكهربيه بالاضافة الى أحدث طرق للمقارنه بين العزلات المختلفة مثل تحليل التتابع النيوكليتيدى للحامض النووى و التحورات عديدة الأشكال للخيط المفرد.

و يمكن تلخيص النتائج المتحصل عليها خلال هذة الدراسه كالاتى :-  

1- و جد أن نبات السترون سلالة أريزونا 861 تتفاعل عند اصابتها بفيرويد تشقق قلف الترايفولياتا حيث طهر عليها ألتواء نصل الأوراق الى أسفل و كذلك تلون العروق الرئيسيه للورقة باللون البنى.

2- تم عزل الحامض النووى الريبوزى RNA لفيرويد تشقق قلف الترليفولياتا من شجرة يوسفى مصابة و ذلك بأستخدام طريقة أطلاق الجين  GRثم أتبعه عمل أستخدام تفاعل أنزيم النسخ العكسى فى بناء الخيط المكمل للجينات الموجودة على الحامض النووى الريبوزى لهذا الفيرويد .

3- تم أكثار المادة الوراثيه للفيرويد و الذى يمثل الطول الكلى للفيرويد من خلال التفاعل المتسلسل لأنزيم البلمرة و بمقارنة الهجرة الكهربية لناتج التفاعل المتسلسل لأنزيم البلمره مع الناتج من عزله فلوريدا ، وجد أن لها نفس الهجرة الكهربية,

4- أستخلص الحامض النووى الريبوزى RNA لكلا من فيرويد تشقق قلف الترايفولياتا و فيرويد الكاككسيا بأستخدام الجواندين ثيوثيانات و تبعه تفاعل النسخ العكسى و تفاعل أنزيم البلمرة المتسلسل و قد أظهرت النتائج أن تفاعل أنزيم البلمرة يمكنه أن يكشف عن 0.10 نانوجرام و .,1 نانوجرام   من الحامض النووى الريبوزى للكاككسيا  و فيرويد تشقق قلف الترليفوبياتا بالتتالى .

5- قد أمكن التأكد من نتائج التفاعل المتسلسل لأنزيم البلمرة عن طريق أستخدام طريقة التهجين للحامض النووى التتابع النيوكليتيدى

.

6- تم أستخلاص الحامض النووى الريبوزى RNA لثلاث عزلات لفيرويد تشقق قلف الترايفولياتا و هم ( العزلة المصريه ، العزله البرتغاليه و الفرنسيه) و أيضا لفيرويد الكاكسيا بصورة منقاه جزئيا و ذلك بأستخدام مادة السيليلوز CF11 و أتبعها عمل تفاعل النسخ الرجعى و تفاعل أنزيم البلمرة المتسلسل .  أظهرت النتائج نجاح هذه الطريقه فى أكثار الطول الكلى و هو حوالى 375 و 300 قاعدة نيكلوتيدية لكل من الثلاث عزلات لفيرويد تشقق قلف الترايفولياتا و الكاكسيا بالتتالى.  

7- تم أستنساخ ناتج تفاعل أنزيم البلمرة المتسلسل لكل عزلات فيرويد تشقق قلف الترايفولياتا و الكاكسيا مع الناقل PGEM-T-easy  وأدخاله فى بكتريا القولون E. coli .

8- تم عزل الناقل المعاد صياغته على مستوى عالى و تنقيتة .

9- تم عمل مسح شامل لمعظم المستعمرات البكتيريه و تقيم للناقل المعاد صياغتة بواسطة تفاعل أنزيم البلمرة المتسلسل و بأستخدام أنزيم القطع ECOR1 و أوضحت النتائج وجود ستة مستعمرات تحتوى على جينوم فيرويد تشقق قلف الترايفولياتا للعزلة المصريه، ثمانية مستعمرات تحتوى على العزلة البرتغالية و أثنين للعزلة الفرنسية. كما أنها أوضحت وجود ثمانية مستعمرات لفيرويد الكاككسيا للعزلة المصرية بالوزن الجزيئى المتوقع.

10- تم التأكد من الناقلات المحتوية على جينوم الفيرويد بعد عزلة من البكتيريا و تنقيتة بواسطة أستخدام تفاعل أنزيم البلمرة المتسلسل، و قد وجد أنها تتتضمن الطول المتوقع لجينوم فيرويد تشقق قلف الترايفولياتا و الكاككسيا و هما 375 و 300  قاعدة مزدوجة على التوالى.

11- تم معرفة و تحديد حساسية و تخصصية تقنية االتهجين للحامض النووى التتابع النيوكليتيدىبأستخدام مجس مرقم بمادة الديج Dig- labeled -cDNA probe مع ناتج تفاعل أنزيم البلمرة المتسلسل المنقط على غشاء من النيلون. و أظهرت النتائج أنه أعطى تفاعل حتى1بيكوجرام و 2 بيكوجرام لكلا من فيرويد تشقق قلف الترايفولياتا و الكاككسيا.

12- تم التأكد من عمل تضاعف للحمض النووى و التشابه بين كل عزلات فيرويد تشقق قلف الترايفولياتا و الكاككسيا موضع الدراسه و الذى تم بواسطة تفاغل البلمرة المتسلسل وجود تشابة فىالتتابع النيوكليتيدى وذلك من النتائج الموجبة المتحصل علتها من تفاعل تهجين الحامض النووى بأستخدام محس غير مشع متخصص

13- تم التأكد من وجود بعض الآختلافات النيوكليتيدية الطفيفة بين عزلات فيرويد تشقق قلف الترايفولياتا بواسطة أستخدام تقنية ألأنماط المتحورة للخيط المفرد للحامض النووى SSCP كمه تم أكتشاف وجود سلالات لفيرويد CEVd تشقق قلف الترايفولياتا داخل نفس العائل. كما ظهر أختلاف بين نمط ال SSCP لناتج تفاعل البلمرة المستخدم فيه بادئ الHSV-Variant لكل مجموعة الHSV و البادئ المتخصص للكاكسيا فيرويدHSV-prototype

14- تم أستخدام كلون الحمض النووى لعزلة  فيرويد ال CEV و الكاككسيا CCaVdالمصريه فى دراسة تشابه التتابع النيوكليتيدى لعزلة الCCaV المصريه مع التتابع النيوكليتيدى المسجل والمنشور فى بنك الجينات و أوضحت الدراسة وجود نسبة تشابه تصل الى 97% لسلالات فيرويدات HSV اليابانى وتشارك حوالى 96 %  لعزلة فلوريدا لفيرويد الكاككسيا و فيرويد CVIIa المسبب المعروف بأسم .mild exocortis"