دراسات على ظروف الحفظ المعملي لمزارع أنسجة بعض أنواع الفاكهة ذات النواة الحجرية

الملخص العربي:

أجريت هذه الدراسة بمعمل زراعة الأنسجة – بالبنك القومي للجينات – مركز البحوث الزراعية – جمهورية مصر العربية خلال الفترة (2003-2006) على بعض الأشجار البذرية لكل من خوخ ميت غمر ومشمش العمار.

وتهدف هذه الدراسة إلى وضع بروتوكول لاكثار هذه الأشجار والتى تتميز بمواصفات جيدة للبيئة المصرية بتقنية زراعة الأنسجة والحفظ المعملى لهذه الأصول الوراثية وذلك للمحافظة عليها من الضياع أو الاندثار كنتيجة لازالتها وزراعة العديد من الأصناف المستوردة من الخارج.

ويمكن تلخيص النتائج المتحصل عليها فيما يلى:

أولاً إنشاء المزارع النباتية وإكثارها:

1- أثناء مرحلة التأسيس كانت أعلى نسبة بقاء لمنفصلات العقد الساقية وأيضاً أطول الفروع تم الحصول عليها باستخدام بيئات موراشيج وسكوج (1962) وبيئة الاشجار الخشبية التى تحتوى على بنـزيل أدنين بتركيز 0.5 مللجرام / لتر وإندول حمض البيوترك بتركيز 0.01 مللجرام / لتر.

2- فى مرحلة التضاعف إستخدم بنـزيل أدنين عند تركيز 4.0 مللجرام / لتر بالإضافة إلى 0.1 مللجرام / لتر إندول حمض البيوترك حيث أعطى أعلى عدد من الفروع لخوخ ميت غمر بينما أفضل الأطوال للفروع سجل مع بيئة موراشيج وسكوج بالإضافة إلى 2.0 مللجرام / لتر بنـزيل أدنين و0.1 مللجرام / لتر إندول حمض البيوترك. ومن جهة أخرى إستخدام البنـزيل أدنين بتركيز 2.0 مللجرام / لتر بالإضافة إلى 0.1 مللجرام / لتر إندول حمض البيوترك أعطى أعلى عدد من الفروع بالنسبة لمشمش العمار بينما أفضل طول للفرع سجل مع بيئة الأشجار الخشبية بالإضافة إلى 1.0 مللجرام / لتر بنـزيل أدنين و0.1 مللجرام / لتر إندول حمض البيوترك. بعد ذلك إستخدمت أفضل بيئة للتضاعف فى عملية النقل كل أربعة أسابيع حتى تم النقل لسبع مرات ووجد أن متوسط الفروع المتكاثرة إزداد بزيادة عدد مرات النقل حتى النقلة الخامسة ثم تناقص أثناء النقلة السادسة والسابعة لمزارع المشمش، بينما تناقص معنوياً بعد النقلة السادسة لمزارع الخوخ.

 3- بالنسبة للتجذير ففى خوخ ميت غمر كانت أعلى نسبة تجذير (87.5 %) وأعلى طول للجذور تم الحصول عليها فى نصف تركيز أملاح بيئة موراشيج وسكوج المحتوية على إندول حمض البيوترك بتركيز 0.2 مللجرام / لتر بالإضافة إلى نفثالين حمض الخليك بتركيز 0.2 مللجرام / لتر، بينما أعلى عدد من الجذور تم الحصول عليه فى نفس البيئة ولكن بإضافة 0.5 مللجرام / لتر نفثالين حمض الخليك. بالنسبة لمشمش العمار كانت أعلى نسبة تجذير (81.25 %) تم الحصول عليها عند إستخدام أيضاً نصف تركيز بيئة موراشيج وسكوج المضاف إليها 0.2 مللجرام / لتر نفثالين حمض الخليك فقط بينما كان أعلى عدد من الجذور تم الحصول عليها عند إضافة إندول حمض البيوترك ونفثالين حمض الخليك كلاً بتركيز 0.5 مللجرام / لتر بينما أعلى طول كان عند إضافة إندول حمض البيوترك بتركيز 0.5 مللجرام / لتر. تم بنجاح أقلمة نبيتات كل من الخوخ والمشمش وكانت نسبة البقاء 66.66 % و50.00 % على التوالى بعد 8 أسابيع من النقل لصوانى الزراعة التى تحتوى على بيت موس ورمل بنسبة 1 : 1.

ثانياً التخزين المعملى:

-        تخزين القمم النامية لكل من الخوخ والمشمش فى المعمل على درجة حرارة الحضانة (25º م ± 2) على بيئة موراشيج وسكوج قوة كاملة مضافاً إليها 0.5 ملجم / لتر بنـزيل أدنين، 0.05 ملجم / لتر إندول حمض البيوترك، 0.7% أجار و0.087 مولر سكروز (كنترول) وماتت هذه المزارع قبل إنتهاء الثلاثة أشهر الأولى من التخزين.

-        تخزين القمم النامية لكل من الخوخ والمشمش على درجة حرارة 4º م فى الإظلام التام على نفس البيئة السابقة بالإضافة إلى بيئات تحتوى على سكروز، سوربيتول بتركيزات ( 0.1 ، 0.2 و0.4 مولر ) بدون إضافة السكروز الذى يحتويه الكنترول (0.087 مولر سكروز) وكذا حمض الأبسيسك بتركيزات (1.0، 1.5، 2.0، 2.5، 5.0 و10.0 ميكرو مولر) وكانت النتائج المتحصل عليها كما يلى:

1- التخزين بإستخدام المواد الإسموزية

- بالنسبة للسكروز والسوربيتول

أ- سجلت أعلى نسبة بقاء(100.00 %) للقمم النامية للخوخ والمشمش بعد 3 أشهر من التخزين وكذلك بعد 6 أشهر من التخزين للتركيزات المختلفة من السوربيتول لكل من الخوخ والمشمش والبيئة المحتوية على تركيز 0.1 مولر سكروز للخوخ فى حين سجل الكنترول أقل نسبة بقاء بعد 9 أشهر حيث ماتت جميع النباتات.

ب- فى نهاية فترة التخزين بعد 12 شهر سجلت أعلى نسبة بقاء للخوخ مع تركيز 0.4 مولر سوربيتول فى حين ماتت جميع القمم النامية للمشمش على التركيزات المختلفة من السكروز وكذا القمم النامية للخوخ مع تركيز 0.4 مولر سكروز.

ج- بالنسبة لعدد الأفرع سجل المشمش أعلى معدل للتفريع مع تركيز 0.4 مولر سوربيتول بعد 9 أشهر من التخزين فى حين فشل الخوخ فى إعطاء أى تفريع خلال فترات التخزين المختلفة.

د- بالنسبة لطول الأفرع سجل المشمش أعلى معدل لطول الأفرع مع البيئة المحتوية على سوربيتول بتركيز 0.1 و0.2 مولر بعد 9 أشهر من التخزين.

2- التخزين بإستخدام مؤخرات النمو

- بالنسبة لحمض الأبسيسك

أ- سجلت أعلى نسبة بقاء(100.00 %) للقمم النامية للخوخ والمشمش بعد 3 أشهر من التخزين فى حين تناقصت نسب البقاء تدريجياً لكل من الخوخ والمشمش حيث وصلت أعلى نسبة بقاء بعد 9 أشهر (79.17 %) للخوخ مع البيئة المحتوية على تركيز 2.5 ميكرو مولر حمض أبسيسك. فى حين ماتت القمم النامية لجميع المعاملات لكل من الخوخ والمشمش بعد 12 شهر من التخزين.

ب- بالنسبة لعدد الأفرع سجل المشمش أعلى معدل للتفريع مع تركيز 10.0 ميكرو مولر حمض أبسيسك بعد 9 أشهر من التخزين فى حين فشل الخوخ فى إعطاء أى تفريع خلال فترات التخزين المختلفة.

ج- بالنسبة لطول الأفرع سجل المشمش أعلى معدل لطول الأفرع مع البيئة المحتوية على تركيز 2.5 ميكرو مولر حمض أبسيسك بعد 6 أشهر من التخزين.

- القدرة على إستعادة النباتات للنمو بعد التخزين

1-      بالنسبة لقدرة النباتات على إستعادة النمو وإنتاج أفرع جديدة، لم يكن هناك فروقاً معنوية بين الفترات 3، 6 أشهر من التخزين لكل من الخوخ والمشمش بإستخدام البيئات المحتوية على السكروز أو السوربيتول، فى حين وجدت فروقاً معنوية بين المعاملات خلال فترة التخزين 9 أو 12 شهر وكذلك بالنسبة لطول الأفرع الناتجة.

2-      بالنسبة لقدرة النباتات على إستعادة النمو وإنتاج أفرع جديدة، لم يكن هناك فروقاً معنوية بين المعاملات لحمض الأبسيسك خلال الفترة الأولى من التخزين (3 أشهر) لكل من الخوخ والمشمش، فى حين وجدت فروقاً معنوية بين المعاملات خلال فترة التخزين 6 أو 9 أشهر وكذلك بالنسبة لطول الأفرع الناتجة.

3- التخزين بإستخدام النيتروجين السائل

أُستخدم المحور الجنينى كمنفصل نباتى فى عملية التخزين وذلك بتعريضه للتجفيف تحت هواء كابينة الزراعة لمدة 1 ، 2 و4 ساعات ثم النقع فى النيتروجين السائل.

 وكانت النتائج المتحصل عليها بعد التخزين كما يلى:

سجلت معاملة المنفصل النباتى بالتجفيف لمدة ساعتين ثم الغمس فى النيتروجين السائل أعلى نسبة للبقاء حيث وصلت إلى 80 % للخوخ و70 % للمشمش وأعلى معدل لانتاج أفرع وكذلك متوسط طول الأفرع الناتجة.

ثالثاً الدراسات الوراثية:

أجرى إختبار تحليل الدنا للمنفصلات النباتية المخزنة لكل من الخوخ والمشمش للتعرف على مدى التغيرات الحادثة بعد التخزين حيث أثبتت النتائج ما يلى:

1-      بالنسبة لمشمش العمار لم توجد أى إختلافات بين الحزم الناتجة من الدنا لمعاملات السكروز بتركيز 0.1 و0.4 مولر والسوربيتول بتركيز 0.1 و0.2 مولر وكذا معاملات حمض الابسيسك بتركيزات 1.0، 1.5، 2.0 ، 2.5 و5.0 ميكرو مولر بالمقارنة بمعاملة الكونترول. بينما وجد إختلاف مع معاملة السكروز بتركيز 0.2 مولر ومعاملة السوربيتول بتركيز 0.4 مولر وحمض الأبسيسك بتركيز 10.0 ميكرو مولر.

2-      بالنسبة لخوخ ميت غمر لم توجد أى إختلافات بين الحزم الناتجة من الدنا لجميع معاملات السكروز والسوربيتول وكذا معاملات حمض الابسيسك بتركيزات 1.0، 1.5، 2.0 و2.5 ميكرو مولر بالمقارنة بمعاملة الكونترول. بينما وجد إختلاف مع معاملات حمض الأبسيسك بتركيز 5.0 و10.0 ميكرو مولر.

5- SUMMARY AND CONCLUSION

The present study was conducted through three successive seasons (2003-2006) in the Tissue Culture Laboratory, National Gene Bank, Agricultural Research Center. Egypt. The study was performed through establishing a protocol for high propagation rate then application of in vitro techniques to plant genetic conservation through minimal growth media using different kind of sugars (sucrose, sorbitol) and growth retardant (ABA). Also, the application of cryopreservation by vitrification and desiccation methods for long term storage of peach and apricot. Also, studied the evaluation of the genetic stability of explants after storage using molecular level based on (ISSR) analysis.

Part I in vitro propagation

Establishment stage

1- The highest survival percentage of stem node explants and the longest shoots were obtained with MS or WPM medium contained BA at 0.5 mg l-1 plus IBA at 0.01 mg l-1 for both species. Meanwhile, control (without growth regulators) gave the lowest survival percentage and the shortest shoot length for both species.

Proliferation stage

1-      Using BA at 2.0 mg l-1 plus 0.1 mg l-1 IBA gave the highest number of proliferated shoots for Al-Amar apricot.

2-      Control treatment and either 2iP or kin at 2.0 mg l-1 failed to induce shoots.

3-      BA, 2iP and kin at 4.0 mg l-1 caused necrosis and all explants died.

4-      The best shoot length was recorded with WPM medium plus BA at 1.0 mg l-1 and 0.1 mg l-1IBA.

5-      BA at 4.0 mg l-1 plus 0.1 mg l-1 IBA gave the highest number of proliferated shoots for Meet-Ghamr peach. Meanwhile, control (zero cytokinins) or 2iP and kin at 2.0 mg1-1 failed to induce shoots.

6-      The best shoot length was recorded with MS medium plus BA at 2.0 mg l-1 and IBA at 0.1 mg l-1 and the lowest insignificant mean shoot length was recorded with 2iP or kin at 4.0 mg1-1.

7-      The average number of new proliferated shoots increased as number of subcultures increased up to the 5th subculture then decreased during the 6th and 7th subcultures for apricot cultures, however it decreased significantly after the sixth subculture for peach cultures.

8-      The highest average shoot length occurred during the 1st and 2nd subcultures then decreased during the 3rd up to the 7th subcultures for the two studied species.

Rooting stage

1-      The greatest rooting percentage (81.25%) for Al-Amar apricot was obtained with half strength MS medium contained NAA at 0.2 mg l-1.

2-      The highest average number of roots was obtained with IBA + NAA both at 0.5 mg l-1 and the highest average root length was obtained with IBA at 0.5 mg l-1.

3-      The lowest rooting percentage and the lowest average number of root and length was obtained with IBA + NAA both at 1.0 mg l-1.

4-      The greatest rooting percentage (87.50%) and root length for Meet-Ghamr peach were obtained with half strength MS medium with IBA at 0.2 mg l-1 plus NAA at 0.2 mg l-1.

5-      The highest average number of roots was obtained in half strength MS medium with NAA at 0.5 mg l-1.

6-      Zero (control) and 0.2 IBA failed to induce rooting. Also, the lowest number of roots was recorded by IBA at 0.5 mg1-1 alone, IBA + NAA both at 0.5 and 1.0 (mg1-1). Meanwhile the lowest root length was obtained with IBA at zero and 0.2 mg1-1.

7- Rooted shoots of both Al-Amar apricot and Meet-Ghamr peach were successfully acclimatized with 50.00 %, 66.66 % survival, respectively.

Part II in vitro conservation

Minimal growth medium with osmotica (sucrose and sorbitol) plus low temperature (4ºC) and darkness

1-      The highest survival percentage (100 %) after 3 months storage was recorded with medium containing all treatments of sucrose and sorbitol for both species.

2-      The highest survival percentage (100 %) after 6 months storage was recorded with medium containing all treatments of sorbitol for both species.

3-      The highest survival percentage (95.83 %) after 9 months storage was recorded with medium containing 0.4 M sorbitol for Meet-Ghamr peach. While, the highest survival percentage (83.33 %) was recorded with medium containing 0.1 M sorbitol for Al-Amar apricot.

4-      The highest survival percentage (79.17 %) after 12 months storage was recorded with medium containing 0.4 M sorbitol for Meet-Ghamr peach. While, the highest survival percentage (50 %) was recorded with medium containing 0.1 M sorbitol for Al-Amar apricot.

5-      The highest number of shoots / explant was recorded with medium containg 0.4 M sorbitol for Al-Amar apricot after 9 months storage.

6-      Meet-Ghamr peach didn’t induced any shoots during all storage periods.

7-      The highest average shoot length (mm) was recorded with a medium containing 0.1 or 0.2 M sorbitol after 9 months storage for Al-Amar apricot.

8-      The survived explants produced new proliferated shoots after regeneration of shoot tip explants after storage 3 or 6 months for sucrose and sorbitol treatments of Al-Amar apricot and Meet-Ghamr peach.

9-      After 9 or 12 months storage, all sorbitol treatments for both species gave the highest number of proliferated shoots. The lowest number of proliferated shoots was obtained by 0.4 M sucrose and 0.1 or 0.2 M sucrose after 9 and 12 months storage, respectively.

Minimal growth medium with growth retardant plus low temperature (4ºC) and darkness

1-      The highest survival percentage 100% was recorded after 3 months storage for Al-Amar apricot and Meet-Ghamr peach then decreased gradually during storage for 9 months for both species.

2-      Control treatment (free ABA) and all treatment of ABA for both species couldn’t survive after 9 months storage.

3-      The highest number of shoots / explant was recorded with medium containg 10.0 µM ABA for Al-Amar apricot during 6 or 9 months storage.

4-      Meet-Ghamr peach didn't induce any shoots during all storage periods compared with Al-Amar apricot.

5-      The highest average shoot length (mm) was recorded with a medium containing 2.5 µM ABA during 6 or 9 months storage for Al-Amar apricot while, Meet-Ghamr peach gave the lowest value.

6-      The survived shoot tip of Meet-Ghamr peacch and Al-Amar apricot stored for 3 months explants produced new proliferated shoots after regeneration.

7-      ABA at 2.0 µM gave the highest number of proliferated shoots. Also, after 6 or 9 months storage, ABA at 2.0 or 2.5 µM gave the highest number of proliferated shoots.

cryopreservation of shoot tip explants using vitrification method.

The vitrification solutions (PVS2, PVS3 and PVS4) and liquid nitrogen (-196 º C) gave the lowest survival percentage (00.00%) of shoot tip explants for Meet-Ghamr peach and Al-Amar apricot after immersion in liquid nitrogen for 1 day.

cryopreservation of embryonic axis using desiccation method.

1- The highest survival percentage was recorded with control treatment or desiccation for 2 hours treatment (85.00% & 75.00%), respectively.

2- The highest number of shoots / explant was obtained by control treatment and 2 hours desiccation periods without significant differences among them for both species. Meanwhile, treatment with desiccation for 4 hours periods gave the lowest value.

3- The highest average shoot length was recorded with control treatment and dsiccation for 2 hours periods. Meanwhile, treatment with 4 hours desiccation periods gave the lowest value.

Part III Genetic study

Molecular markers of Al-Amar apricot and Meet-Ghamr peach based on Inter Simple Sequence Repeats (ISSR)

1- For Al-Amar apricot the high similarities with control treatment were recorded with (0.1, 0.4 M) sucrose, (0.1, 0.2 M) sorbitol, and (1.0, 1.5, 2.0, 2.5 and 5.0 M) ABA treatments.  Meanwhile, treatments with 0.2 M sucrose, 0.4 M sorbitol and 10.0 M ABA showed some changes of DNA bands compared with control treatment.

2- For Meet-Ghamr peach the high similarities with control treatment were recorded with treatments of sucrose or sorbitol (0.1, 0.2 and 0.4 M) and 1.0, 1.5, 2.0 and 2.5 M ABA treatments.  Meanwhile, treatments with 5.0 and 10.0 M ABA showed some changes of DNA bands compared with control treatment.