B. thuringiensis التوصيف الوراثي لبعض أنواع الباسلس فى التربة المصرية بالمقارنة بالنوع

                                                "الملخص العربى

العزل والتوصيف الوراثى لبعض انواع الباسيلس الموجودة بالأراضى المصرية ومقارنتها بالباسيلس ثيرانوجينسيس

اجريت هذه الدراسة فى الفترة من 1999-2004 بمعامل قسم الوراثة – بكلية الزراعة – جامعة عين شمس وتهدف الى الأتى:

1- عزل بعض انواع الباسيلس من التربة المصرية وتصنيفها على المستوى المورفولوجي والكيميائي.

2- التفريق بين الأنواع المختلفه على المستوى البيوكيماوى والجزيئى

قام البحث بجمع عدد 13 عينة من التربة المصرية من أربع محافظات مختلفة (القاهرة والجيزة والقليوبية والمنوفية) تم تعريض هذه العزلات لعدد من الإختبارات لمعرفة جنس الباسيلس وبالفعل تم إختيار أربع منها إستخدمت فى الدراسة مقارنة بأربع سلالات قياسية من الباسيلس مختلفة المصادر(مركز الثروة الميكروبية بالكلية و المبيد الحيوى التجارى ديبل إكس وسلالة قياسية من الدكتور ناكامورا بأمريكا)

تم دراسة  (الأختلافات بين التراكيب الوراثيه للباسيلس على المستوى البيوكيماوى والجزيئى) لكلا من الطرز الحزميه للبروتينات الكليه والمتبلوره وكذلك الطرز الحزمية الناتجة من تقنية تفاعل البلمره المتسلسل للبادئات العشوائيه وتم توظيف هذه النتائج لعمل بصمه وراثيه وتقدير علاقات التشابه والقرابة  بين التراكيب الوراثيه المختلفه للباسيلس وتتلخص نتائج هذه الدراسه فى الآتى:

1-            أظهرت نتائج تحليل الطراز الحزمى للبروتينات الكليه بواسطة التفريد الكهربائى على الأكريلاميد أن عدد الحزم الكلية هى 40 حزمه تراوحت أوزانها الجزيئيه ما بين 320- 52.4 كيلو دالتون وخلصت نتائج التحليل لهذه الطرز الى وجود اثنين من الحزم الشائعة بوزن جزيئى 139.9 و 52.4 كيلو دالتون والتى وجدت فى جميع التراكيب الوراثيه للباسيلس تحت الدراسة، كما تم تحديد حزمة رقم (37) بوزن جزيئى قدره 53 كيلودالتون يمكن إعتبارها علامة موجبة للسلالتين القياسيتين)   باسليس ثيراجينسيس)  ( Bt13 - المبيد الحيوى ديبل إكس (Bt2 - , كما تم تحديد عدد 3 حزم إعتبرت كعلامة سالبة لنفس السلالتين بحجم 88.3 و 74.9 و 68.6 كيلو دالتون على الترتيب, عند دراسة درجة القرابة بين التراكيب الوراثية للباسيلس تحت الدراسة سجلت العزلة iso52 أعلى درجة قرابة (تشابه) (79.2%) بينها وبين (السلالة باسليس ثيراجينسيس Bt13-), وأقل درجة للقرابة (42.1%) سجلت بين السلالة  (باسيلس بوليمكسا Bp ) و السلالة (المبيد الحيوى ديبل إكسBt2 )

و عموما فالتفريد الكهربائى للبروتينات الكليه غير كافى للتميز بين الطرز الوراثيه التسع من الباسيلس المستخدمه تحت الدراسه.

2- أوضحت نتائج تحليل الطرز الحزمية  للبروتينات المتبلوره بواسطة التفريد الكهربائى أن العدد الكلى للحزم 36 حزمه تراوحت أوزانها الجزيئيه ما بين 135.4 – 9.3 كيلو دالتون , و سجلت الحزمه رقم 13  (66.1 كيلو دالتون) كعلامه موجبه لجميع للتراكيب الوراثية للباسيلس تحت الدراسه و كما تم تحديد الحزمـــة رقم 1 ( 135.4 كيلو دالتون ) كعلامة سالبة للسلاله (الباسيلس سيريس-(Bc , كما أوضحت نتائج دراسة درجة التشابه الى وجود درجة تشابه (قرابة) مرتفعة بين العزلتين  iso 47 و iso 52 حيث بلغت  1و79 % بينما كانت درجة التشابه (قرابة) منخفضة حيث بلغت 7و16 % بين السلالتين  باسيلس سيريس-Bc و باسليس ثيراجينسيس-Bt13

عموما أظهرت نتائج التفريد الكهربائى للبروتينات المتبلوره قيم غير فعاله للتميز بين الطرز الوراثيه التسع من الباسيلس المستخدمه تحت الدراسه.

وعلى ذلك وبناءا على النتائج المتحصل عليها للبصمه الوراثية البيوكيماوية للطرز الوراثيه التسعه من الباسيلس من الممكن أن نستخلص أن توظيف البروتينات الكليه والمتبلوره كانت غير فعالة فى تحديد التشابه والتمييز بين طرز الباسيلس المستخدمه.

3- عند دراسة التمييز وتحديد درجة التشابه (القرابة) بين الطرز الوراثية التسع للباسيلس تحت الدراسة على المستوى الجزيئى (DNA) استخدم البحث 14 بادئ عشوائى أعطت 174 حزمة كلية متضخمة منها 169 حزمه متعددة المظهر بنسبة 1و97 %. كما نجحت 91 حزمة (52.3 %) فى إيجاد علامات متخصصة (88 علامة موجبة و 3 علامات سالبة) للتسع طرز الوراثية للباسيلس تحت الدراسة. أكبر عدد من العلامات الوراثيه الخاصه ( 33 علامة) ظهر بالعزلة iso52 بينما أقل عدد (4 علامات) للعزلة iso41 .

عند دراسة درجة التشابه وشجرة القرابه بإستخدام التحليل للحزم الناتجة من البادئات العشوائية إلى وجود درجة تشابه عالية بين العزلتين iso47  و  iso52 بلغت نسبتها المئوية 57% (مما يوضح أن بينهم درجة تقارب وراثى) بينما كانت درجة التشابه منخفضة بين العزلتين  iso 41 و iso52 حيث بلغت نسبتها 20.4% (مما يوضح أن بينهم درجة تباعد وراثى)

4- عند دراسة درجة القرابه الوراثيه بإستخدام البروتينات الكلية والمتبلورة وكذا البادئات العشوائيه إلى وجود علاقه قويه بين العزلتين  iso47 و iso52 بنسبة 2و78%  بينما كانت أقل درجات التشابه (31.4 %) بين العزلة iso 41 و السلالة الباسيلس سيريس-Bc.

النتائج السابقة أكدت أن إستخدام نتائج تحليل الطرز الحزمية لتقنية تفاعل البلمرة المتسلسل بإستخدام البادئات العشوائية أكثر فعالية من إستخدام تحليل الطرز الحزمية لتفريد الكهربائى للبروتينات الكلية أو المتبلورة فى التفرقة وتمييز علامات جزيئية للطرز الوراثية من جنس الباسيلس, كما خلصت النتائج إلى أن العزلتين iso47 و iso52 سجلتا أعلى درجة من التقارب وراثيا و أيضا يقتربان من كونهما باسيلس ثيرنجينسيس مقارنة بالسلالات القياسية المستخدمة فى الدراسة 

V. SUMMARY

The present study was carried out over fine consecutive years (1999-2004) and aimed to investigate the following:

1- Isolation of some species of Bacillus from Egyptian soil and characterization of them at the morphological and chemical levels.

2- Differentiation between different species on the biochemical and molecular level.

Results of the present study were focused mainly on detecting and weighting polymorphism between Bacillus genotypes on the biochemical and molecular levels.

Total and crystal proteins banding patterns and RAPD-PCR were employed to fingerprint and estimate the relatedness of Bacillus genotypes.

The main results of this study:

1- SDS-PAGE analysis of total protein 40 bands were detected with different molecular weights (MW) ranged from about 320- 52.4KDa.

The patterns of total protein analysis were concluded that there were two common bands (with about MW 193.9 and 52.4 KDa) which found in all Bacillus genotype.

Regarding these 40 amplified bands, two standard B. thuringiensis (Bt2) and (Bt13) were characterized by one common band (no 37) at MW of 53 KDa, was considered as a positive marker band for these genotypes.

While, three bands (no 17, 20 and 22) with a MW about 88.3, 74.9 and 68.6 KDa, respectively were considered as positive markers for two B. thuringiensis strains (Bt2 and Bt13).

The strongest relation ship was scored between strain Bt13 and iso52 (79.2%), followed by strain B. subtillus (Bs) and B. cereus (Bc) (73.2%), while strain Bt2 and strain Bp were shown to be the most genetically distant genotypes (similarity of 42.1%).

In general, the SDS-PAGE of total protein was not efficient in discriminating among the nine genotypes of Bacillus under investigation but it is helpful in characterization of genotype within the same species.

2- The analysis of SDS-PAGE electrophoresis pattern for crystal proteins in Bacillus  genotypes showed that the maximum number of 36 amplified bands was detected with molecular weight (MW) ranged from 135.4 - 9.3KDa. Band no. 13 with a molecular weight about 66 kDa was found in all Bacillus  genotypes, these bands reveal a positive-specific marker for Bacillus  spp. Band no. 1 with a MW about 135.4kDa was found in all genotypes except Bacillus  cereus (Bc), this band reveals a negative-specific marker for this strain.

The analysis of similarity matrix revealed that the strongest relationship was scored between iso47 and iso52 (79.1%), while strain Bt13 and Bc were shown to be the most genetically distant genotypes (16.7%).

Generally, the results of crystal Protein electrophoresis technique have a not sufficient value in determination Bacillus genotypes-specific banding pattern and Bacillus taxonomy.

Considering the results mentioned before as a biochemical fingerprinting for the nine studied Bacillus  genotypes, it could conclude that the employment of protein banding patterns (as a total or crystal proteins) variation as tools for the detection of similarities and dissimilarities of the studied Bacillus  genotypes are inconsiderable useful tools.

3- Fourteen random primers were used in the present study resulted in the appearance of PCR products with varied bands number. A total of 174 amplified bands were detected across the 14 random primers, 169 of them were polymorphic (97.1%).

As high as 91 out of the 174 (52.3%) RAPD-PCR markers were found to be useful as Bacillus genotypes- specific markers. The largest number of RAPD-PCR specific markers (33 markers) were scored for the Bacillus isolate 52 (iso 52), while the lowest number (4 markers) were scored for the isolate (iso 41). A number of 88 specific markers were scored for the presence of a unique band for a given genotypes (positive marker), while 3 were scored for the absence of a common band (negative marker). The largest number of RAPD-PCR genotype-specific markers was generated by primer OP-B03 (17 markers) followed by primer OP-B04 (16 markers).

The similarity matrix and the phylogentic dendrogram revealed that the strongest relationship was scored between isolate 47 and isolate 52 (57%), while isolate 41 and isolate 52 were shown to be the most genetically distant genotypes (20.4%).

The analysis revealed that the strongest relationship was scored between iso47 and iso52 (78.2%), while isolate 41 and Bc were shown to be the most genetically distant genotypes (31.4%).

4- The analysis of phylogenetic relationship was generated using RAPD-PCR and proteins markers revealed that the strongest relationship was scored between iso47 and iso52 (78.2%), while isolate 41 and Bc were shown to be the most genetically distant genotypes (31.4%)."