فصل بعض المركبات ذات الفاعلية كمضادات حيوية من الاستربتوميسيس المعزولة من البحر الأبيض المتوسط

ملخص الدراسة:

الاكتينوميسيتات علي وجه العموم والاستربتوميسيس بصفة خاصة تعتبر هي المصدر الرئيسي لانتاج المضادات الحيوية التي يدخل الكثير منها في مجال العلاج والادويه وبالتالي فان هذه الدر اسه تهدف لعزل ودراسة الاستريبتوميسيس المنتجة للمضادات الحيوية والموجودة في البيئة البحرية المصرية وذلك من مناطق مختلفة في البحر الأبيض المتوسط (سيدي بشر - ميامي –العصافره- الميناء الشرقية). تتضمن هذه الدراسة عزل وتنقية وتعريف عزلات الاستربتوميسيس البحرية ودراسة الخصائص البيوكيميائيه والتضاد يه لهذه العزلات 0 كذلك دراسة تأثير الظروف المثلي لانتاج تلك المضادات الحيوية من السلالات المنتخبة ذات الانتاجيه العالية واخيرا عزل تلك المركبات الفعالة وتنقية وتعريف ودراسة الخصائص الفيزيائية والكيميائية لكل منها علي حده ويمكن تلخيص النتائج المتحصل عليها كما يلي:

1- تم تجميع عينات مختلفة من مياه البحر والرواسب البحر يه من مناطق مختلفة في البحر الأبيض المتوسط (سيدي بشر – ميامي –العصافره– الميناء الشرقية) بغرض عزل سلالات الاستريبتوميسيس البحرية الموجودة بها 0

2 - عزلت 50 عزله من الاستريبتوميسيس البحرية وكانت الرواسب البحرية افضل من مياه البحر كمصدر لعزل الاستريبتوميسيس البحرية وبالنسبة للبيئات، تعتبر بيئة النشا والارجنين هي افضل البيئات المستخدمة في عملية العزل حيث أنها حققت اعلي عدد من مستعمرات الاستريبتوميسيس البحرية وكذلك أنواع مختلفة منها والتي يمكن تمييزها من خلال الاختلافات المورفولوجية (الشكل واللون)0

3- من خلال الخصائص البيولوجية لتلك العزلات البحرية وجد أنها تنتمي لجنس

 الاستربتوميسيس وتبعا للون الميسليوم الهوائي تم تقسيمها إلي مجموعتين :

أ‌-    مجموعة الاستربتوميسيس ذات الميسليوم الرمادي وهى يمثل 68 % من مجموع العزلات.

ب‌-  مجموعة الاستربتوميسيس ذات الميسليوم الأصفر وهو يمثل 32 % من مجموع العزلات.

جميع هذه العزلات ذات سلاسل طويلة من الجراثيم ذات الجدر الملساء وباستكمال عملية التعريف أمكن التعرف علي أنواعها كما يلي:

S. antibioticus MME 6270, Streptomyces exofoliatus MME 2156, Streptomyces noboritoensis MME 4796, Streptomyces purpureus MME 3010, Streptomyces halstedii MME 1910, Streptomyces aburaviensis MME 2012, Streptomyces albidoflavus MME 2166, Streptomyces anulatus MME 3074 and Streptomyces champavatii MME 4148 .

4- كانت العزلات التالية هي الأفضل من حيث الكفاءة التضاد يه:-

S. antibioticus MME 6270, S. noboritoensis MME 4796, S. purpureus MME 3010 and S. aburaviensis MME 2012 لذلك تم اختيار هذه العزلات لاستكمال بقية الدراسات عليها.

5- وجد أن تركيب بيئة التخمر يؤثر تأثيرا كبيرا علي كفاءة إنتاج المضادات الحيوية ومن البيئات المختبرة للوصول للإنتاجية المثلي كانت بيئة A هي المثلي لسلالة S. antibioticus MME 6270 حيث كان لها القدرة علي تثبيط 16 ميكروب باستخدام بيئة A وكانت بيئةE هي المثلي لسلالة S. noboritoensis MME 4796 حيث أظهرت اعلي قدره تضاديه باستخدام هذه البيئة 0من ناحية أخري كانت بيئة Gو بيئة B هي المثلي لانتاج المضادات الحيوية بواسطة S. purpureus MME 3010 and S. aburaviensis MME 201 علي التوالي.

6- تم إجراء بعض الدراسات بهدف الوصول بظروف التنمية إلى الظروف المثلي لانتاج المضادات الحيوية بواسطة سلالات الاستربتوميسيس البحرية موضوع الدراسة وفي ذلك الشأن يمكن تلخيص النتائج المتحصل عليها كما يلي:

أ‌-    يبدأ إنتاج المضادات الحيوية في اليوم الثاتث والرابع من تنمية كلا من S.. antibioticus

 MME 6270 وS. aburaviensis MME 2012 وتصل الإنتاجية إلى اعلي معدلاتها بعد 6و7 أيام من التنمية (يتم الإنتاج خلال طور الثبات) علي التوالي بينما يبدأ إنتاج المضادات الحيوية بعد اليوم الأول من التنمية وتصل الإنتاجية إلى اعلي معدلاتها بعد 3 و4 أيام من التنمية (يتم الإنتاج خلال طور النمو اللوغاريتمي).

ب- أمكن الحصول علي أعلي معدلات النمو والإنتاجية بتحضين العزلات خلال مدي حراري 27-30م0

ج- بدراسة تأثير رقم الأس الهيدروجيني (pH)علي كلا من النمو والإنتاجية وجد أن الإنتاج الأمثل

منهما بواسطة S. antibioticus MME 6270 يتحقق عند درجة pH 7 , (6- 5,6) علي التوالي بينما أعلي معدلات النمو والإنتاجية بواسطةS. noboritoensis MME 4696 يتحقق عند رقم الأس الهيدروجيني 8 لكن عند رقم الأس الهيدروجيني 7 تلاحظ أعلي معدلات النمو والإنتاجية بواسطة S. purpureus MME 3010 وعند pH 5,7 وكذلك 6 – 5,6 لكلا من النمو والإنتاجية بواسطة S. aburaviensis MME 2012 علي التوالي.

د- بدراسة تأثير تركيز الفسفور في البيئة علي كلا من النمو والإنتاجية بواسطة السلالات موضوع

 الدراسة وجد أن أعلي نمو لهذه السلالات يتحقق عند تركيز من الفسفور يتراوح بين 06,-07, مول بينما اعلي معدلات إنتاجيه المضاد الحيوي يتحقق عند 02, مول بواسطة S. antibioticus MME 6270 وعند 01, مول بواسطة S. noboritoensis MME 4796 وعند 05, مول بواسطة S. purpureus MME 3010 وعند 07, مول بالنسبة لسلالة.S. aburaviensis MME 2012 ه- بدراسة تأثير نوع وحجم وعمر اللقاح علي كلا من النمو وإنتاجيه المضادات الحيوية بواسطة السلالات موضوع الدراسة وجد أن تلقيح بيئة الإنتاجية بنسبة 4% لقاح عمر 96 ساعة نامي في بيئة رقم 3 يعطي أعلي إنتاجيه من المضادات الحيوية بواسطة S. antibioticus MME 6270 وأن تلقيح بيئة الإنتاجية بنسبة 2 % لقاح عمر 72 ساعة نامي في بيئة رقم 1 يحث أعلي إنتاجيه للمضادات الحيوية بواسطة S. noboritoensis MME 4796. استخدام 1 % لقاح عمر 48 ساعة نامي في بيئة رقم 6 كان أمثل لانتاج المضادات الحيوية بواسطة S. purpureus MME 3010 لكن تحقيق أعلي إنتاجيه من المضادات الحيوية بواسطة S. aburaviensis MME 2012 يتطلب التلقيح بنسبة 10 % لقاح عمر 120 ساعة نامي في بيئة رقم 4.

و‌-   بدراسة تأثير درجة التهوية علي كلا من النمو وإنتاجيه المضادات الحيوية بواسطة السلالات

موضوع الدراسة وجد أن درجة التهوية 3 كانت هي الأمثل لتحقيق أعلي معدلات إنتاجية المضادات الحيوية بواسطة S. antibioticus MME 6270 وكذلك purpureus MME 3010 S. بينما أعلي معدلات إنتاجية المضادات الحيوية بواسطة S. noboritoensis MME 4796 وكذلك S. aburaviensis MME 2012 يتحقق عند درجة تهويه 4.

ز- يؤثر نوع مصدر الكربون الموجود في البيئة بدرجه كبيره علي إنتاجية المضادات الحيوية وقد

 لوحظ أن السكريات المختلفة مثل الجلوكوز، المانوز، الفركتوز، المالتوز، النشا تشجع كلا من النمو وإنتاج المضادات الحيوية بواسطة antibioticus MME 6270 S. لكن أعلي إنتاجيه من المضادات الحيوية بواسطة S. noboritoensis MME 4796 قد تحقق فقط مع استخدام النشا كمصدر الكربون حيث أن استبداله بالسكريات الأحادية أو الثنائية أو العديدة أو الكحوليات سبب تثبيط إنتاج تلك المضادات الحيوية. من ناحية أخري فان أعلي إنتاجيه من المضادات الحيوية بواسطة purpureus MME 3010 S. تلاحظ بإضافة الجلسرول وتنخفض تلك الإنتاجية إلى صفر مع أي مصدر كربوني أخر ما عدا الجلوكوز الذى أعطي تركيزات منخفضة من الانتاجيه0 إنتاج المضادات الحيوية بواسطة 2012 S. aburaviensis MMEبكميات محسوسة قد تم الحصول عليه باستخدام الجلوكوز أو النشا كمصدر الكربون.

ح- ضمن التركيبات المختلفة بالتركيزات المختلفة المستخدمة من مصادر الكربون المثلي التي تحقق أعلي إنتاجيه وجد أن استخدام خليط يتكون من 1% فركتوز بالاضافه إلى 1% مالتوز يحقق أعلي إنتاجيه من المضادات الحيوية بواسطة S. antibioticus MME 6270. زيادة تركيز النشا إلى 2% كان الأمثل لتحقيق أعلي إنتاجيه بواسطة S. noboritoensis MME 4796 بينما زيادة الإنتاجية في حالة S. aburaviensis MME 2012 قد استلزم إضافة خليط يتكون من 1% الجلوكوز و5 , % من النشا.

ط- بدراسة تأثير نوع مصدر النيتروجين الموجود في البيئة علي كلا من النمو وإنتاجيه المضادات الحيوية وجد أن مصادر النيتروجين العضوية كانت مناسبة لكلا من النمو وإنتاج المضاد الحيوى بواسطة سلالات االاستربتوميسيس البحرية المختبرة في معظم الأحيان. علي الرغم من أن مصادر النيتروجين الغير العضوية في الصورة المؤكسدة أعطت حصيلة جيده من النمو وإنتاجيه المضادات الحيوية فان الصورة المختزلة قد أعطت نموا جيد ولكنها ليست فعاله من حيث إنتاج المضادات الحيوية. هذا وقد وجد أن استخدام كلا من فول الصويا ومستخلص اللحم والببتون يحث إنتاج المضادات الحيوية بواسطة S. antibioticus MME 6270, S. noboritoensis MME 4796, S. purpureus MME3010 and S. aburaviensis MME 2012 علي التوالي.

ي- بدراسة تأثير إضافة الأحماض الأمينية علي كلا من النمو وإنتاجيه المضادات الحيويه بواسطة سلالات االاستربتوميسيس البحرية المختبرة وجد أن الأحماض الأمينية الكبريتية لها تأثير مشجع لانتاج المضادات الحيوية بواسطة S. antibioticus MME 6270 بينما حث تكوين المضادات الحيوية بواسطة S. noboritoensis MME 4796 يتم باستخدام البرولين لكن إضافة التربتوفان تحقق اعلي معدلات التخليق بواسطة purpureus MME 3010 S. في حين يعتبر الألانين هو افضل الأحماض الأمينية التي تشجع تخليق المضادات الحيوية بواسطة S. aburaviensis MME 2012.

ك- وجد أن اعلي معدلات إنتاج المضادات الحيوية تتحقق مع إضافة فيتامين ب12 لبيئة تخمر كلا من antibioticus MME 6270 S. وكذلك S. noboritoensis MME 4796 بينما لوحظت اعلي معدلات الإنتاج مع إضافة فيتامين بارا-امينوبنزويك أسيد لبيئة تخمر كلا من S. noboritoensis MME 4796 وS. aburaviensis MME 2012 ووجد أيضا أن إضافة البيوتين أو الثيامين يحث إنتاج المضادات الحيوية بواسطة purpureus MME 3010 S..

7- ضمن معاملات الاستخلاص المختلفة بغرض استخلاص المضادات الحيوية من ميسليوم سلالات الاستربتوميسيس موضع الاختبار وجد أن الدمج بين الطرق الكيميائية والفيزيائية للاستخلاص (دورات من التجميد والتسيييح للميسليوم متبوعة بالاستخلاص بالمذيب العضوي المناسب) كانت هي الطريقة المثلي للاستخلاص لجميع السلالات المختبرة S. antibioticus MME 6270, S. noboritoensis MME 4796, S. purpureus MME3010, S. aburaviensis MME 2012. من ناحية أخرى فان الطريقة المثلي لاستخلاص المضادات الحيوية من راشح النمو الميكروبي للسلالات purpureus MME3010. ,S. antibioticus MME 6270 S. noboritoensis MME 4796. يتحقق من خلال تحميض الراشح باستخدام حامض الهيدروكلوريك المركز متبوعا بالاستخلاص بواسطة الايثيل اسيتيت وعلي النقيض وجد أن رفع قلوية الراشح باستخدام هيدروكسيد الصوديوم متبوعا بالاستخلاص بواسطة الايثيل اسيتيت يحقق أعلي معدلات الاستخلاص من  S. aburaviensis MME 2012

8- تم عزل وتعريف 14 مركب مختلف من سلالات الاستربتوميسيس البحرية موضع الاختبار كما يلي:-

أ-  مركبات A, B, C, D, E من سلالة S. antibioticus MME 6270

ب- مركبات  F, G, H من سلالة S. noboritoensis MME 4796

ج - مركبات   I, J, K من سلالة purpureus MME3010 S.

د- مركباتL, M, N   من سلالة S. aburaviensis MME 2012

جميع هذه المركبات المعزولة فيما عدا المركبين D, I أظهرت فاعليه كمضادات حيوية ضد العديد من سلالات البكتريا الموجبة والبكتريا السالبة لجرام وكذلك الفطريات والخمائر.

1-   بإجراء دراسات التعريف المختلفة على هذه المركبات المعزولة تبعا لخصائصها الفيزيائية والكيميائية وجد أنها تنتمي لمجاميع مختلفة من المضادات الحيوية كما يلي :-

 أ- مركبات A, M تنتمي إلى مجموعة المضادات الحيوية الكينونية.

   ب-  مركبات B L, E, تنتمي إلى مجموعة. المضادات الحيوية اللتي تحتوى على

      حلقة عطرية.

ج‌-   مركب C ينتمي إلى مجموعة المضادات الحيوية الحلقية اللتي تحتوى على نيتروجين.

د‌-   مركبات D, I  لا تنتمي إلى مجموعة المضادات الحيوية الميكروبية.

ه-  مركب F ينتمي إلى مجموعة المضادات الحيوية الاليفاتية اللتي تحتوى على حلقة عطرية.

    و-  مركباتG تنتمي إلى مجموعة المضادات الحيوية الحلقية.

ز‌-   مركبات H تنتمي إلى مجموعة المضادات الحيوية الاليفاتية اللتي لا تحتوى على حلقة عطرية..

ح‌-   مركبات J, N تنتمي إلى مجموعة المضادات الحيويةالكربوهيدراتية اللتى تحتوى على نيتروجين.

   ط- مركب K ينتمي إلى مجموعة المضادات الحيوية الآمينوجليكوسيديه.