دراسات وراثية على تحمل الإجهاد البيئي لبعض السلالات المصرية من الذرة الشامية

                                                "تهدف هذه الدراسة الي تحديد وتوصيف بعض المستنسخات المكملة (cDNA) التي تُشفَر عند تعريض خلايا الخميرة الي ضغوط ملحية و تعريف إحداها وعزله ونقله الى سلالة الذرة الشامية المصرية جيزة 643 بغرض تحسين مقاومتها للظروف الملحية مع الأخذ في الإعتبارخطة العمل الآتية:-

1.            تعريف بعض العزلات المصرية من الخميرة المقاومة للضغوط الملحية والاسموزية.

2.            عزل بعض المستنسخات المكملة (cDNA)  ذات العلاقات المباشرة بالمقاومة للضغوط الملحية.

3.            كلونة وتحديد تتابع بعض من هذه المستنسخات المكملة  (cDNA) .

4.            التوقع الوظيفي لكل مستنسخ علي حده باستخدام قواعد البيانات الجينية المنشورة عالمياً.

5.            اختبار انسب مستنسخ مكمل من حيث الوظيفة ومعرفة التتابع الوراثي للجين المسئول عنه كاملاً باستخدام تقنية التضاعف السريع لنهايات المستنسخات المكملة(RACE) .

6.            نقل الجين الكامل الذي تم تعريفه إلي أحد سلالات الذرة الشامية المصرية كنواة للحصول علي صنف مقاوم للضغوط الملحية.

وكان من أهم النتائج المتحصل عليها في هذا البحث:-

1.            من بين ستة عزلات من ميكروب الخميرة المعرضين لضغوط ملحية بتركيز 2 مولر كلوريد صوديوم   (2 M NaCl) وضغوط اسموزية بتركيز 2 مولر سوربيتول (2 M Sorbitol)  تم اختيار السلالة رقم 1 حيث اظهرت اعلي نسبة حيوية وقدرة علي النمو تحت كلا الضغطين الملحي والاسموزي.

2.            تم عزل الحمض النووي الريبوزي  الكلي Total RNA من السلالة رقم 1 بعد  تعريضها لتركيز  2 مولر كلوريد صوديوم (2 M NaCl) لفترات صفر  20، 40، 60 دقيقة.

3.            تم التفرقة بين التعبير الجيني للسلالة المعاملة مقارنة بالكنترول علي مستوي المستنسخات المكملة باستخدام تقنية Fluorescent differential display .

4.            تم اختيار ثلاثة حزم وراثية (أرقام 7و 19و 20) حيث ظهرت بوضوح في جميع فترات التعريض للضغط الملحى (20، 40، 60 دقيقة) واختفت تماما في الفترة صفر ، وكانت اطوالها جميعاً تزيد عن 100 زوج من القواعد.

5.            تم عمل كلونة لجميع الحزم الثلاث في ناقل pGEM-T والحفاظ عليها في سلالة XL1 Blue بكتريا القولون E. coli

6.            تم تحديد التتابع النيوكليوتيدى للحزم الثلاثة اتوماتيكياً ومقارنة النتائج المتحصل عليها بالبيانات المتاحة في قواعد البيانات الجينية المنشورة عالميا لمعرفة المزيد من المعلومات عن هذه القطع الجينية.

7.            أظهرت نتائج المقارنة ان الثلاثة حزم كانت بالفعل منتمية لجينوم خميرة الخباز Saccharomyces servisae . وكانت الحزمة الاولي جزء من جين محمول علي الكرموسوم الرابع ويطلق عليه  GPD1 وهو المسئول عن تراكم مادة الجلسيرول داخل الخلية لرفع ضغطها الاسموزي كاستجابة للتعرض للضغوط الملحية وتخفيف وطأها على الخلية.

8.            تماثلت القطعة الثانية مع جزء من جين محمول علي الكرموسوم الرابع ويطلق عليه STL1 وهو الجين المسئول عن انتاج بروتين لنقل السكريات خلال الجدار الخلوي.

9.            تماثلت القطعة الثالثة مع عامل النسخ المحمول علي الكرموسوم الثالث عشر ويطلق عليه HOT1

10.         تم اختيار القطعة الاولي والتي تمثل جزء من جين  GPD1 لإستكمال الاختبارات عليها حتي الحصول علي التتابع الكامل للجين لأهميته فى أنتاج الجليسرول.

11.         تم الحصول علي الطول الكامل  لجين  GPD1 بطريقة معدلة من تقنية التضاعف السريع لنهايات المستنسخات المكملة(RACE)  وهي ®GeneRacer والتي تتميز بمضاعفة المستنسخات الكاملة الطول فقط دون الالتفات الي غيرها.

12.         تم كلونة الطول الكامل لجين  GPD1 في ناقل pCR-4 ونقله الي العديد من سلالات بكتريا القولون E. coli بهدف التاكد من تعبيره ودراسة درجة تأثيره في تحسين صفة مقاومة الملوحة لهذه السلالات.

13.         تم أستحداث ناقل جديد للعمل داخل الخلايا النباتية ((pAGPD وقد أُستخدم فى بنائه الناقل pACH17 كمصدر للمشغل p-ubi والمنهي للنسخ NOS حيث يعمل كليهما علي تنظيم التعبير الجيني داخل النبات.  وتم اضافة جين GPD بينهم ليصبح صالحا للنسخ داخل النباتز

14.         تم استخدام سلالة جيزة 643 من الذرة الشامية كمصدر لللأجنة غير الناضجة التي تم تجميعها علي بيئة N6 بعد 10-15 يوم من التلقيح حيث تم قذف الناقل  pAGPD اليها باستخدام قاذف الجينات بالشروط الملائمة ( علي مسافة 6 سم وبضغط يوازي 1100 psi وبمعدل قذيفتان للمرة).

15.         تم انتخاب الكالس المحول وراثيا علي بيئة N6 المحتوية علي تركيزات صفر ، 50، 100 ، 200 مليمولر كلوريد صوديوم.

16.         أظهرت المعاملة 100 مليمولر أفضل مستوي إنتخابي للخلايا المحولة وراثياً وتم نقلها الي بيئة MS تحتوي علي نفس التركيز من كلوريد الصوديوم للحصول علي نباتات متكشفة.

17.         كما أُجريت جميع الاختبارات الجزيئية اللازمة للتأكد من دخول الجين (بواسطة إختبار تفاعل البلمرة االمتسلسل PCR ) وكذلك التعبير الوراثى عنه (بواسطة إختبار Northern-blotting )

                وكنتيجة نهائية تعتبر جميع الحزم الوراثية التي اظهرت تباين عن الكنترول هي عبارة عن أجزاء من جينات أو عوامل منظة تُنسخ كاستجابة مباشرة للتعرض للضغوط الملحية مما يعطي فكرة بعد دراستها عن طبيعة عمل الخلية ككل تحت التاثير. وقد تم بالفعل الاستفادة من أحد هذه الأجزاء للحصول بواستطها علي التتابع الكامل للجين المسئول عن هذه الحزمة وهو جين GPD1 حيث يعمل علي تراكم مادة الجلسيرول داخل الخلية مما يعمل علي رفع ضغطها الاسموزي مما يؤدي بدورة الي زيادة كفاءة الخلية علي تحمل الضغط الملحي، وقد تم استخدام العديد من التقنيات الحديثة المتطورة لهذا الغرض مما أتاح الفرصة لنقل هذا الجين الي أحد سلالات الآباء في الذرة الشامية كنواة للحصول علي أصناف من الذرة الشامية مقاومة للملوحة. كما تم تطوير تقنية الإنتخاب المباشر علي البيئات الغذائية باستخدام الضغط الملحي مباشرة دون اللجوء إلي استخدام كشاف اختباري selectable marker."